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1. ヒト多能性幹細胞からのヒトニューロン誘導
- レンチウイルス製剤(~5日)
- プレートは~100万のヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞各T75フラスコで、トランスフェクションを行うときにそれらを~40%コンフルエントにします。テトラサイクリン誘導性ニューロゲニン2(Ngn2)およびピューロマイシン耐性遺伝子(PuroR;同じTetオペレーター(TetO)プロモーター制御下)を発現するプラスミド、逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)、および3つのヘルパープラスミドpRSV-REV、pMDLg/pRRE、およびVSV-G(レンチウイルスベクターDNA12 μg、ヘルパープラスミドDNA各6 μg)をトランスフェクションします。レンチウイルス製剤ごとに少なくとも3つのフラスコを準備します。トランスフェクションにはポリエチレンイミン(PEI)をメーカーの指示に従って使用してください。16時間後にメディアを交換し、廃棄します。
- ハーベストは、毎日培地を採取してウイルス粒子を放出し、3日間新鮮な培地と交換しました。ウイルス粒子を含む収集した培地をプールして精製します。0.22 μmフィルターでウイルスをろ過し、49,000 x gで90分間遠心分離します。ペレットを適切な量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-グルコース(~150 μL)に再懸濁します。
- ニューロン誘導 (~5 日)
手記： この誘導プロトコル(図1A;フロー図)は、検証済みの多能性人工多能性幹細胞(iPS)および胚性幹細胞(ES)細胞の両方に対して非常に効果的です(これは、十分に特徴付けられた多能性マーカーの免疫組織化学染色によってアッセイできます。図1B)。
- 市販のH1ヒトES細胞を52の継代で使用してください(材料の表を参照)。ES細胞維持培地(材料表を参照)を使用して、細胞外マトリックス溶液でコーティングされた6ウェルプレート(6ウェルプレートあたり~0.5 mgのマトリックス溶液、材料表を参照)で細胞を培養し、プレートを5%CO2で37°Cでインキュベー
トします。
- -2日目に、ES細胞(80%コンフルエント)を1 mLの細胞剥離溶液(材料の表を参照)で分離し、室温で10分間インキュベートします。細胞をチューブに移し、ウェルを2 mLの培地で洗浄し、同じチューブで組み合わせます。300 x gで5分間遠心分離し、ペレットを培地に再懸濁し、細胞をマトリックスコーティング6ウェルプレートに播種密度1 x 105細胞/ウェルでプレートします。
- -1日目に、Ngn2とPuroRおよびrtTAを発現するレンチウイルスをポリブレン(8 μg/ml)とともに、新鮮なES細胞維持培地中のES細胞に加えます(材料の表を参照)。ウイルスの正確な数は、実際の力価または滴定によって決定する必要があります。通常、6ウェルプレートにウェルあたり5μLのウイルスを加えます。
- 0日目に、ダルベッコの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM-F12)培地にドキシサイクリン(2μg / mL、Ngn2発現を活性化するため)をモルフォゲンなしのN2サプリメントとともに追加します。
- 1日目に、DMEM-F12とN2およびドキシサイクリンの新鮮な培地にピュロマイシンを添加し、最終濃度の1 μg/mL培地にします。ウイルス力価が低い場合、導入不足の細胞を適切に除去するには、より高いピューロマイシン濃度(最大5 μg/mL)とより長い選択期間(最大48時間)が必要です。
- 2日目に、細胞剥離溶液(材料の表を参照)で分化ニューロンを剥離し、マトリックス溶液でコーティングされた24ウェルプレート(80,000〜200,000細胞/ウェル)に再播種し(材料の表を参照)、ドキシサイクリンを含まないニューロベースA(NBA)/B27培地で維持します。播種密度は重要です。
- この段階では、分離したニューロンを特殊な市販の凍結培地(材料の表を参照)で凍結し、液体窒素で最大3か月間保存できます。純粋なニューロンは、融解後の典型的な~15%〜20%の細胞死を考慮してプレーティングするか、単独で培養するか、他の脳細胞タイプと共培養することができます(OPCとの共培養についてはステップ3.2.3を参照)。
メーカーの指示に従って、- 細胞外マトリックスベースの溶液でコーティングしたプレート上で純粋なiNを培養します(材料の表を参照)。特徴的なピラミッド型の形態は、4日目(および6日目;図1C)。シナプス形成は、14日目から16日目という早い時期に検出でき、標準的なシナプス前およびシナプス後のマーカーによる免疫組織化学染色により、24日目に顕著になります。(図1D;シナプス前マーカーSynapsin 1および樹状突起マーカーMap2で標識)。
2. 多能性幹細胞からのヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の誘導とオリゴデンドロサイトの成熟
- 神経前駆細胞(NPC)の生成:単層プロトコル(~7日)。フロー図については、図 2A を参照してください。
- 前述のようにH1ヒトES細胞を培養し(ステップ1.2.1を参照)、デュアルSMADiと呼ばれる確立されたアプローチにより、複数のシグナル伝達経路に対する低分子阻害剤を用いて、神経前駆細胞(NPC)に分化させます。ここでは、広く受け入れられている市販のキットを使用し、メーカーが提供する単層プロトコルに従います(材料の表を参照)。
- -1日目に、成長因子低減マトリックス溶液(材料表を参照)でコーティングされた6ウェルプレートに、1ウェルあたり0.5–1 x 106細胞をプレート化し、ES細胞維持培地(材料表を参照)でコーティングします。この成長因子低減マトリックス溶液は、次のステップで使用されるすべてのプレートをコーティングするために使用されます。
- 0日目に、2% DMSOを添加したES細胞維持培地(材料表を参照)で細胞を24時間処理します。
- 1〜6日目に、市販のキットからSMAD阻害剤を含む温かい(37°C)神経誘導培地でフルメディアを交換します(材料の表を参照)。7日目までに細胞が分裂して合流点に達した場合は、ステップ2.1.2で前述したように、0.5–1 x 106の播種密度に細胞を継ぎます。
- 7日目に、細胞剥離溶液(材料の表を参照)を使用し、播種密度1〜2×105細胞/ウェルの24ウェルプレートでNPCを継代する。
- 免疫組織化学染色(IHC)により、多能性マーカー、オクタマー結合転写因子4(OCT4)などの不存在、およびペアボックス6(PAX6)、ネスチン、性決定領域Y-box転写因子1(Sox1)などのNPCマーカーの存在について、分化効率をアッセイします。
- この段階では、切り離されたNPCは、専用の商用NPC凍結培地(材料表を参照)で凍結し、液体窒素で最大3か月間保存できます。一度凍結融解した後も、NPCは信頼性の高いプロトコルでニューロン、アストロサイト、OPCを生じさせる多能性を保持しています。
- オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の生成(~7日)。フロー図については、図2Aを参照してください。
- 7日目に、細胞剥離溶液(材料の表を参照)を使用してNPCを継代し、温かい(37°C)神経誘導培地と市販のキットのSMAD阻害剤(材料の表を参照)で、24ウェルプレートに1〜2 x 105細胞/ウェルの播種密度でプレートします。
- 8日目に、OPC分化培地に1%ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液を調製し、めっきNPCを24時間処理します。OPC 分化培地は、DMEM/F12 培地、1% N2 サプリメント、1% B27 サプリメント、20 ng/mL の塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、1 μM の平滑アゴニスト(SAG)、10 ng/mL の血小板由来成長因子-AA(PDGF-AA)で構成されています(材料表を参照)。
- 9日目に、DMSOを含まない新しいOPC分化培地に培地を交換します。15日目まで隔日で細胞に栄養を与えます。細胞が15日目より前にコンフルエントに達した場合は、ステップ2.2.1で説明したように、ウェルあたり1〜2 x 105細胞の播種密度に細胞を継代します。
- 14日目に、OPC分化培地でOPCを1〜2 x 105細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートにプレート化します。
- この段階(15日目)で、IHC染色またはqPCRによるOPC特異的マーカーの存在について細胞をテストします(例:O4、オリゴデンドロサイト系統転写因子[Olig]-1/2、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4/ニューロングリア抗原2[CSPG4 / Ng2[、NK2ホメオボックス2 [NKX2.2]、血小板由来成長因子受容体アルファ[PDGFRa];図2B)NPCマーカー(Pax6またはNestin;図 2D)。通常、15日目には95%以上の細胞でO4免疫反応性を検出します。アルツハイマー病と特に関連性があるのは、OPCではAPP(アミロイド前駆体タンパク質)、BACE1(プロセシングプロテアーゼβ-セクレアターゼ1)、ペプチドアミロイドβ(Aβ)の発現が豊富であることです(図2F)。
3. ヒト誘導ニューロン(iN)とオリゴデンドロサイト前駆細胞(iOPC)の共培養
- iOPC めっき (~3 日)
- OPC分化培地(ステップ2.2.2で説明)中の24ウェルプレート(ステップ2.2.4で説明)で、1ウェルあたり1×105細胞の密度で14日目にiOPCをプレート化します。
- iN-iOPC共培養のセットアップ
- 15日目に、ピューロマイシン選択後の2日目のステップ(ステップ1.2.6で説明)で誘導されたヒトニューロンを細胞剥離溶液で分離します(材料の表を参照)。
- 培養したOPCにニューロンを添加し、24ウェルプレートのウェルあたり2 x 105細胞の播種密度で、成長するOPCをプレーティングします(ステップ3.1.1から)。Neurobasal-A培地、2% B27サプリメント、および100 ng/mL T3トリヨードチロニンを含む共培養培地を使用してください。翌日に媒体を交換し、その後は一日おきに交換します。OPCの増殖が速すぎて3日以内にコンフルエントに達する場合は、2〜5μMの濃度でシトシンアラビノシド(Ara-C)を添加します。7日後のニューロンの共培養で成長したiNおよびiOPCの代表的な画像を図3Aに示します。
- ステップ1.2.7で上述したように調製した凍結ニューロンをOPCとの共培養に使用します。凍結融解ニューロンをウェルあたり3 x 105細胞の高密度でプレート凍結融解します。
- 共培養での14〜16日目以降、iNのシナプス形成は、シナプス前およびシナプス後マーカーのIHC染色によって観察でき、21日目までにシナプス点が豊富になり(図3C)、ニューロン活動を確実に記録できます。
- 21日目から、OL特異的マーカー(例えば、ミエリン塩基性タンパク質[MBP]およびプロテオリピッドタンパク質1[PLP1])について細胞をテストします。28日目までに、通常、特定のマーカーのIHC染色によって標識されたiOLプロセスによるiN軸索の被覆現象が観察されます(図3B;iN軸索のニューロフィラメント[NF]とiOPCプロセスのMBP)。
