1. 実験の準備
- 基底膜マトリックス(BMM)コーティングプレートを調製します.
手記：BMMは、温度が高いほど急速に固化します。プレートは、保存のために迅速かつすぐに4°Cで調製する必要があります。
- BMM(材料表を参照)を氷上で、4°Cで少なくとも2時間、または一晩
解凍します。
- ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)/F12とBMMを混合して、最終濃度80 μg/mLにします。BMM溶液を組織培養皿(35 mm皿に1 mL、60 mm皿に2 mL)に分配し、細胞をプレーティングする前に、37°Cで少なくとも1時間または一晩インキュベートします
注:未使用の皿は4°Cで2週間保存できます。
- ポリ-L-オルニチン/ラミニン(PLO/ラミニン)コーティングプレートを調製します。
- 滅菌済みのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS+/+)に20 μg/mL PLO(材料表を参照)を調製し、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLを添加します。インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、真空吸引器でPLOを吸引し、DPBS+/+で2回洗浄します。フード内で風乾します.
注:風乾プレートは、将来の使用のために、アルミホイルで包んで4°Cで最大2週間保存できます。
- DPBS+/+ で 10 μg/mL ラミニン(材料表を参照)を調製し、6 ウェルプレートの各ウェルに 1 mL を添加します。インキュベーター内で少なくとも3時間または37°Cで一晩インキュベートします。
- 真空吸引器でラミニンを吸引し、1 mLの培地または滅菌DPBS+/+.
注:ラミニンコーティングは乾燥してはいけません。これを防ぐために、PBSまたは適切な培地をすぐに追加する必要があります。コーティングされたプレートは、4°Cで最大2週間保存できます。
- PSC継代液を調製します。
- 11.49 gの塩化カリウム(KCl)と0.147 gのクエン酸ナトリウム二水和物(HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O)を400 mLの滅菌細胞培養グレードの水に溶解します(材料の表を参照)。
- 溶液の体積を測定し、初期体積(Vi)として記録します。
- 浸透圧を測定し、Vi × Oi = Vf × 570 mOsm の式を使用して滅菌細胞培養グレードの水を追加することで、浸透圧を 570 mOsm に調整します。
- 溶液を0.20μmフィルターでフィルター滅菌し、10mLのアリコートを調製します。アリコートは室温(RT)で最大6か月間保管してください。.
- 多能性幹細胞(PSC)培地を調製します.
注:iPS細胞は、熱安定性線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む培地で維持され(材料表を参照)、週末の給餌スケジュールがなくなります。他の市販のPSC培地は、このプロトコルでは試されていません。
- PSC培地サプリメントを4°Cで一晩解凍します。
- 500 mLの基礎PSC培地に10 mLのPSC培地サプリメントを加えます。25 mLのアリコートを調製し、-20 °C.
で保存します。
注:冷凍アリコートは-20°Cで6ヶ月間保存できます。解凍したアリコートは4°Cで保存し、2週間以内に使用する必要があります。細胞は、10%(v/v)のジメチルスルホキシド(DMSO)を含むPSC培地で凍結して長期保存することができます。
- PSC解凍媒体を準備します。
- PSC 培地に 50 nM クロマン、1.5 μM エムリカサン、1x ポリアミンサプリメント、および 0.7 μM trans-ISRIB (CEPT カクテル) を添加します (材料表を参照)。
- 0.20 μmフィルターでフィルター滅菌し、4°Cで最大4週間保存します。
- 引っ張ったガラスピペットを準備します。
- 22.9 cm(9インチ)のガラス製パスツールピペットをブンゼンバーナーの上で、首から~2 cm下まで2つに引き込み、薄い方の部分がもう片方より~4 cm短くなっている2つのピペットを作成します。
- 炎の助けを借りて、引っ張った側の先端を曲げて滑らかな「r」を作成します。
- 引っ張ったピペットをオートクレーブスリーブとオートクレーブに入れて滅菌します。
- 小脳分化培地(CDM)を準備します。
- イスコーブの変性ダルベッコミディアム(IMDM)とハムのF12栄養素ミックスを1:1の比率で混合します。1x L-アラニン-L-グルタミンサプリメント、1%(v/v)既知性脂質濃縮物、0.45 mM 1-チオ-グリセロール、15 μL/mLアポトランスフェリン、5 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、および7 μg/mLインスリンを混合物に添加します(資料の表を参照)。
- 0.20μmのフィルターでフィルター滅菌し、4°Cで保存し、1ヶ月以内にご使用ください。
- 小脳成熟培地(CMM)を調製します。
- 1x L-アラニン-L-グルタミンサプリメントと1x N-2サプリメントをニューロベース培地に補給します(資料表を参照)。
- 0.20μmフィルターでフィルター滅菌し、4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。
2. フィーダーフリーiPS細胞培養
- 以下の手順に従ってセルを解凍します。
- BMMプレート(ステップ1.1)を37°Cインキュベーターに入れ、細胞を解凍する前に少なくとも1時間または一晩ゲル化します。
- 10 mLのPSC解凍培地(ステップ1.5)を37°Cで予温します。
- 細胞を含むクライオバイアルを液体窒素から37°C.
の水浴に移します
注:細胞培養空間で汚染源が発生しないように、標準的なウォーターバスの使用はお勧めしません。代わりに、真水を小さなビーカーで37°Cに加熱して、1回限りのウォーターバスを生成できます。
- チューブに小さな氷片が残ったら、ウォーターバスから取り出してチューブを乾かし、70%エタノールをスプレーします。チューブをフードに移し、2 mLまたは5 mLの血清ピペット(材料の表を参照)を使用して、細胞を15 mLのコニカルチューブに穏やかに移します。
- 8 mLのPSC解凍培地を、コニカルチューブを渦巻かせながら細胞に滴下します。200 x gで5分間RTで遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱さずに真空吸引器で上清を慎重に吸引します。細胞を2 mLのPSC解凍培地に再懸濁します。
- プレートからBMMを吸引し、再懸濁した細胞をプレート全体に滴下して均一に分配します。
- プレートをインキュベーターに37°C、5%CO2で置きます。翌日、PSCメディアでメディアをリフレッシュします。その後、毎日媒体を交換してください。
- 以下の手順に従ってセルを維持します。
- 必要な量のPSC培地を37°Cで予温します(例:35 mmプレートあたり1 mLの培地)。
- プレートの分化細胞またはコロニーを調査し、プルドガラスピペットで分化細胞を取り出します(ステップ1.6).
注:iPSCコロニーは、形態学的に同一の細胞を持つ滑らかなエッジを持っています。
- 使用した培地を毎日交換し、3〜4日ごと、または70%のコンフルエントに達したときに通過します。
- 細胞を継ぎます。
- 必要な量のBMMプレートをインキュベーターに少なくとも1時間または一晩置いてから、通過させます。必要な量のPSC培地(ステップ1.3)を37°Cで予温します。
- 引っ張ったガラスピペットを使用して、分化した細胞やコロニーを洗い流します。
- 使用済み培地を真空吸引器で吸引し、PSC解離培地を35 mm皿あたり1 mL加えます。37°Cで1-3分間インキュベートします.
注:PSC培地を添加する前にPSC継代溶液中でコロニーが浮き上がっている場合、インキュベーション時間を短縮できます。
- PSC継代溶液を吸引し、予め加温したPSC培地を追加します。
- 滅菌済みの200 μLピペットチップを使用して、スクラッチラインを一方向に平行にし、プレートを90°回転させ、前のスクラッチラインに垂直な2番目のスクラッチラインのセットを作成します(プレートを横切るクロスハッチパターンを作成します)。
- セットプレートからBMM溶液を吸引します。血清学的ピペットを使用してコロニーを採取し、新しいBMMプレートに分配します。
- 37°C、5%CO2でインキュベートします。媒体は毎日交換してください。
- セルを凍結します。
- 内容物にラベルを付けてクライオバイアルを調製し、フード内の紫外線(UV)光(材料表を参照)で30分間滅菌します。
- PSC培地に10%(v / v)DMSOを添加して、PSC凍結培地を調製します。手順2.3.2〜2.3.5に従います。
- 細胞を5 mLの血清ピペットを備えた15 mLのコニカルチューブに移し、200 x gでRTで5分間遠心分離します。
- 培地を慎重に吸引し、細胞ペレットをPSC凍結培地に再懸濁します。
- クライオバイアルに分配します。バイアルを冷凍容器に入れ、容器を-80°Cの冷凍庫に入れます。
- 翌日、クライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。
3. 小脳の分化
>注:分化を開始する前に、iPS細胞は6つの35 mmディッシュに継代され、70%の合流度に達したときに分化の準備が整います。各35 mmプレートは、6ウェルプレートの1つのウェルに移されます。
- 0日目に、EB形成のために健康なiPS細胞コロニーを持ち上げます。
- 10 μM Y-27632および10 μM のSB431542(材料表を参照)を添加したCDM1 mL(ステップ1.7)を6ウェル超低アタッチメント(ULA)プレートの各ウェルに加え、持ち上げたコロニーをウェルに追加する準備ができるまでインキュベーターに入れます。
- プルガラスピペットを使用して分化した細胞を洗浄します。培地を吸引し、35 mmディッシュごとに1 mLのPSC継代溶液を追加します。37°Cで3分間インキュベートし、吸引し、10 μM Y-27632および10 μM の SB431542.
を添加したCDM2 mLを添加します
手記：CDMを添加する前にPSC継代溶液中でコロニーが浮き上がると、インキュベーション時間を短縮できます。
- 透過光倒立顕微鏡下で、引っ張ったガラスピペットの曲がった端を4倍の倍率でコロニーを静かに持ち上げます。すべてのコロニーを持ち上げたら、10 mLの血清ピペットを使用して、すべてを6ウェルULAプレートの1つのウェルに静かに移します。このプロセスを各iPSCプレートに対して繰り返します。細胞を37°Cで5%CO2.
でインキュベートします
手記：コロニーが大きすぎるか、マージされている場合は、プルしたガラスピペットの先端でスライスして、より小さなEBを作成できます。
- 2日目に、各ウェルにFGF2を最終濃度50 ng/mLまで追加します
手記： 小脳分化に使用されるFGF2は熱安定性がありません。このプロトコルは、熱安定性のあるFGF2ではテストされていません。
- 7日目に、1/3のミディアムチェンジを行います。ウェル中の全培地3 mLについて、1,000 μLピペッターで使用済み培地1 mLを静かに吸引し、1 mLの新鮮なCDMと交換します。EBを7日間インキュベートします。
- 14日目に、1,000 μLピペッターを使用して、使用済みの培地のほぼすべてを静かに吸引します。EBへの損傷を最小限に抑えるには、プレートを回転させてすべてのEBをプレートの中央に集めてから、プレートを傾けて端からゆっくりと吸引します。
- 中量が減ったら、プレートをゆっくりと平らに置き、吸引を続けます。EBが乾燥しないように、十分な培地を残しておきます。その後、10 μM Y-27632を添加した3 mLの新鮮なCDMを加えます。10 mLの血清学的ピペットを使用してEBをPLO/ラミニンコーティングディッシュに移します(ステップ1.2).
手記：ダウンストリームのアプリケーションに応じて、EBを6ウェルPLO/ラミニンプレートに移すことも、単一のEBをPLO/ラミニンコーティングされた24ウェルプレートまたはカバースリップの1つのウェルに移すことも可能です。
- 15日目に、培地を吸引し、新しいCDMと交換します
手記：時間の経過とともに蒸発するため、給餌の間に十分な培地を確保するために、ウェルに十分な培地を追加することが重要です(たとえば、6ウェルプレートのウェルの場合は、3 mLの培地を追加します)。培地が酸性化し始めた(透明で黄色に変色する)場合は、プロトコルの終了まで給餌スケジュールにない場合でも、培地をリフレッシュしてください。
- 21日目に、使用済みの培地を吸引し、CMMと交換します。28日目に、新しいCMMで培地を交換します。35日目に、さらなるアプリケーションのために細胞を回収します。
