ヒト人工多能性幹細胞由来胚様体からのニューロンおよびグリア細胞の生成

要約

出典:Pistollato, F., et al.神経毒性試験のためのニューロンとグリアの混合培養物へのヒト誘導多能性幹細胞の分化のためのプロトコル。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、胚様体(EB)を神経上皮凝集体に分化させ、その後のニューロン細胞とグリア細胞への分裂のプロセスを示しています。この方法により、in vitroで神経細胞およびグリア細胞を効率的に生成することができ、毒性試験の試験システムとして、また神経毒性に関与するさまざまな経路の評価としても機能します。

プロトコル

1. HiPSCの混合ニューロンとグリアへの分化

>注: この手順は、図 1 で概説されている主な手順で完了するのに約 28 日かかります。

1. 胚様体(EB)の生成(0日目→1日目)
   注:この手順には、優れた手動スキルと精度が必要です。HiPSC(ヒト人工多能性幹細胞)コロニーフラグメントは、次のステップで均質な胚様体(EB)を得るために、同じサイズである必要があります。形態学的に分化したコロニー(大きな細胞質画分と小さな核小体を持つ)は廃棄する必要があります。
   1. 無菌条件下で未分化の hiPSC コロニー (直径約 1 mm、図 2A を参照) を切断する前に、hiPSC 培地 (3 mL/60 mm シャーレ) をリフレッシュしてください。
   2. 未分化コロニー(図2Aおよび図2Bを参照)を、30G針付きの1mLシリンジを使用して、約200μm×200μmの断片に切断します。室温の層流キャビネットで4倍の倍率で実体顕微鏡を使用します。
   3. 200 μLのピペットを使用して、培地を下に静かにピペッティングして破片を持ち上げ、コロニーの断片を皿の表面から取り除きます。
   4. 剥離したすべてのフラグメントと培地を、1、2、または5 mLピペットを使用して15 mLチューブに移します。
   5. 2 mLの完全ヒトiPS細胞培地で皿をすすぎ、すべての断片を回収します。
   6. 112 x gで1分間遠心分離します。
   7. 上清を吸引し、フラグメントを 5 mL の完全 hiPSC EB 培地に穏やかに再懸濁します(材料の表を参照)。
   8. コロニーフラグメントを60 mmの超低アタッチメントシャーレ(5 mL / 60 mmシャーレ)にプレートします。
   9. ペトリ皿を37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。
   10. 翌日(1日目)に、1、2、または5mLのピペットを使用して、EBとその培地を15 mLのチューブに集めます。
   11. EBを112 x gで1分間遠心分離します。
   12. 上清を慎重に吸引し、1、2、または5 mLのピペットを使用して、EBを5 mLの完全hiPSC EB培地に穏やかに再懸濁します。
   13. EBを新しい60 mm超低アタッチメントシャーレ(5 mL/60 mmシャーレ)に再プレートします。
   14. ペトリ皿を37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。
2. 1日目に、基底膜マトリックス(例えば、マトリゲル、以下「標準マトリックス」と呼ぶ)または他の適切なタンパク質基質(例えば、ラミニン)で皿をコーティングする。
   1. 標準マトリックス(材料表を参照)を、冷たく1.5 mLチューブと冷たく5 mLまたは10 mLのピペットを使用して、200 μLアリコートに-80°Cで保存します。
   2. 200 μLの標準マトリックスを氷上で解凍します。
   3. 200 μL の標準マトリックスを 20 mL の基礎 (DMEM/F12) 培地 (1:100 希釈) で希釈します。
   4. 60mmのシャーレにこの溶液(5mL /皿)をコーティングします。
   5. コーティングした皿を37°Cで一晩インキュベートします.
      手記：これらの皿は、EB (約 50 EB/皿) をプレート化し、神経上皮凝集体 (ロゼット) を生成するために使用されます。ステップ 1.3 を参照してください。
3. 神経上皮凝集体(ロゼット)の生成(2日目→7日目)
   1. 2日目に、60 mmシャーレから標準マトリックスコーティング溶液を取り出し(プレートをすすぐ必要はありません)、5 mL/ディッシュの完全神経上皮誘導培地(NRI)で満たします。材料の表を参照してください。
   2. 200 μL ピペットを 4 倍の倍率で実体顕微鏡で 200 μL ピペットを使用して、フローティング EB (ステップ 1.1.14 から) をコーティングディッシュ (~50 EBs/ディッシュ) に移し、層流キャビネットに入れます><。 手記：均質な中型のEBs(直径200~300 μm)を選択することが重要です。小さすぎるEBは神経外胚葉分化中にうまく生き残れない可能性があり、大きすぎるEBはコア壊死を起こす傾向があります。
   3. 皿を37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
   4. 翌日(3日目)は、顕微鏡で10倍の倍率で皿をチェックし、EBがすべて付着していることを確認します。
   5. 完全なNRI培地を使用して、全培地交換を静かに行います。
   6. NRI培地は、神経上皮凝集体(ロゼット)が見える7日目まで、1日おきに交換してください。
   7. 7日目に、ステップ1.2で説明したように、標準マトリックス(またはラミニン)を任意の必要なプレートまたはディッシュフォーマットにコーティングします:96ウェルプレート(100 μL/ウェル)、24ウェルプレート(250 μL/ウェル)、12ウェルプレート(500 μL/ウェル)、MEAチップ(電気的活性用、1 mL/シングルウェルチップ)、または60 mmシャーレ(4 mL/ディッシュ)。
   8. コーティングされたプレート/ディッシュを37°Cおよび5%CO₂で少なくとも2時間インキュベー
   トします。
4. ロゼット解離と神経分化(8日目→28日目)
   注:この手順には、優れた手動スキルと精度が必要です。中胚葉細胞と内胚葉細胞の収集を避けるために、外胚葉のロゼット様構造のみを解離して収集する必要があります。
   1. 8日目に、無菌状態で10倍の倍率で実体顕微鏡下でロゼット様構造を断片に切断します。1mLのシリンジと30Gの針を使用します。ロゼットは針で触れると皿から外れやすいので注意してください。
   2. 200 μLピペットを使用してロゼットフラグメントの分離を完了します。
   3. ディッシュを層流フードの下に移し、1、2、または5mLのピペットを使用して、ロゼットの破片とその培地を15mLの円錐管に集めます。2 mLのNRI培地で皿をすすぎ、すべての断片を回収します。
   4. ロゼットフラグメントを112 x gで2分間スピンダウンします。
   5. 上清を吸引します。
   6. ペレットを1 mLの1x DPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)に穏やかに再懸濁し、1,000 μLのピペットを使用してロゼットフラグメントを上下に静かにピペットで動かし、部分的に解離させます。
   7. 4 mLの完全NRI培地を加え、トリパンブルーと自動セルカウンター(材料表を参照)を使用して細胞をカウントします
      手記：20 μLの細胞懸濁液を20 μLのトリパンブルーで希釈します。このステップは、細胞を単一細胞懸濁液に入れることができない場合に省略できます。ロゼットフラグメントが完全に解離していないように見える場合は、表1に示すように、約50 EB/60 mmディッシュに由来するロゼットフラグメントを50 mLの完全NRI培地に再懸濁し、プレーティングすることができます。
   8. ペトリ皿、プレート、および/またはMEAチップから標準マトリックス(またはラミニン)コーティング溶液を吸引します(ステップ1.3.7から)。乾かさないでください。
   9. 研究計画に従って、細胞を完全なNRI培地に播種します(約15,000細胞/cm²、播種量の適応については表1を参照)。
   10. プレートを37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。
   11. 10日目に、完全なニューロン分化培地(ND)を使用して全培地交換を行う;材料の表を参照。
   12. 完全なND培地を週に2回、28日目まで更新します。

>表 1.

解離したロゼットめっき密度に関する注意:ロゼットの断片が完全に解離していないように見える場合、約15.000細胞/cm2の細胞めっき密度を達成するために、約50 EBs/1 x 60mm皿に由来する解離したロゼット断片を50 mLの完全NRI培地に再懸濁し、次のようにめっきすることができます（プレートのフォーマットによって異なります）:

名 名

マルチウェルプレート / MEA	成長面積(cm2 /ウェル)	ウェルあたりのプレートへのセル懸濁液の量(またはMEAチップ)	プレーティング可能な最大プレート数(細胞懸濁液50 ml)
96ウェル	0.3	100 UL	5
48ウェル	0.7	220 UL	4
24ウェル	2	625 ul	3
12ウェル	4	1.25ミリリットル	3
6ウェル	10	3.125ミリリットル	2
シングルウェルMEAチップ	3.5	1.1ミリリットル	45

結果

図1:ニューロン分化プロトコルの概略図。(上部)IMR90-hiPSCコロニーは、断片に切断して胚様体(EB)を形成することができます。2 日間の in vitro (DIV) 後、EB をラミニンまたは標準的なマトリックスコーティング皿に播種し、神経上皮誘導 (NRI) 培地の存在下で培養して、神経外胚葉誘導体 (ロゼット、ここではネスチン (緑) と β-III-チューブリン (赤)) を生成します。ロゼットは、解離、収集、ラミニンまたは標準的なマトリックスコーティング皿に再メッキし、さらにニューロン分化(ND)培地の存在下で成熟ニューロン(NF200、赤)およびグリア(GFAP、緑)細胞に分化させることができます。(下部)ロゼット由来のNSC(ネスチン、赤)は、神経誘導(NI)培地の存在下で増殖し、凍結保存し、またはND培地の存在下でさらに分化させて、混合ニューロン(NF...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
hiPSC EB媒体:
ノックアウトDMEM	サーモフィッシャー	〒10829-018	(ステップ 2.1.7)
ノックアウトセラムリプレイスメント(KOSR)	サーモフィッシャー	〒10828-028	最終濃度 20% (ステップ 2.1.7)
非必須アミノ酸	サーモフィッシャー	11140-035	(ステップ 2.1.7)
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140-122	最終濃度 50 U/mL(ステップ 2.1.7)
L-グルタミン 200 mM 溶液	サーモフィッシャー	〒25030-081	2 mM 最終濃度 (ステップ 2.1.7)
β-メルカプトエタノール	サーモフィッシャー	〒31350-010	50 μM 最終濃度 (ステップ 2.1.7)
完全神経上皮誘導媒体(NRI):
DMEM/F12	サーモフィッシャー	〒3133-038	(ステップ 2.3.1)
非必須アミノ酸	サーモフィッシャー	11140-035	(ステップ 2.3.1)
N2サプリメント	サーモフィッシャー	17502-048	(ステップ 2.3.1)
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140-122	最終濃度 50 U/mL(ステップ 2.3.1)
ヘパリングレードI-A、≥180 USP単位/ mg	シグマ・アルドリッチ	H3149-100KUさん	最終濃度 2 μg/mL (ステップ 2.3.1)
bFGFの	サーモフィッシャー	13256から029	使用前に最終濃度20 ng/mLを添加(ステップ2.3.1)
マトリゲル基底膜マトリックス	コーニング	354234	1:100(ステップ2.2)。マトリゲルを氷上で解凍し、200 ulのアリコートを準備し、-80°Cで保存します。コーティングの場合は、200 ulアリコートを20 mlの冷たいDMEM / F12培地で希釈します。.
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020	1:100(ステップ2.2)。PBS 1Xで希釈します。
完全神経分化培地(ND):
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャー	21103049	(ステップ 2.4.11)
B-27サプリメント(50倍)	サーモフィッシャー	17504044	(ステップ 2.4.11)
N2サプリメント	サーモフィッシャー	17502-048	(ステップ 2.4.11)
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140-122	最終濃度 50 U/mL(ステップ 2.4.11)
GDNFの	サーモフィッシャー	PHC7045	1 ng/mLの最終濃縮。使用前に追加。(ステップ 2.4.11)
BDNFの	サーモフィッシャー	PHC7074	最終濃度は2.5ng/ml。使用前に追加。(ステップ 2.4.11)

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