マウス胚性脳組織からのドーパミン作動性ニューロンの培養と維持

要約

出典:Weinert, M. et al., Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons from Embryonic Rodent Brains. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、マウスの胚性脳組織からドーパミン作動性ニューロンを培養する方法の概要を示しています。このプロセスには、中脳をタンパク質分解酵素で処理し、細胞を剥離し、抗生物質を含む栄養豊富な培地でポリマーコーティングされたカバーガラスで細胞を培養し、成長と長期的な生存率を高めることが含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腹側中脳細胞の解離

1. 腹側中脳の断片を層流フードの下に移します。ハンクスの平衡塩溶液(HBSS)を取り出し、予熱した1 ml(37ºC)の0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)を円錐管(腹側中脳の最大12個分)に加えます。.組織を37°Cで5〜10分間インキュベートします。
2. フードの下のトリプシン-EDTAを取り外し、1 mlの不活性化培地(血清がトリプシンを非アクティブ化します)を組織に追加します。.
3. 不活性化培地を取り出し、ティッシュを1mlの完全培地で2回洗浄します
   手記：解離した細胞が廃棄されるのを防ぐため、チューブからすべての培地を取り出して組織をピペッティングすることは避けてください。
4. 1 mLの完全培地を加え、ファイヤーポリッシュ仕上げのガラスピペットでティッシュを粉砕します。気泡の形成を避け、単一細胞懸濁液が達成されるまでトリチュレーションを続けます.
   注:通常、完全な解離には、制限された先端を8〜10回通過する必要があります。
5. 細胞を400 x gで室温(RT)で5分間遠心分離し、培地を取り除きます。
6. ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁し、最大4回までゆっくりとピペッティングします。

2. 腹側中脳細胞のめっき

1. 細胞懸濁液10 μlを90 μlのトリパンブルー溶液と混合し、血球計算盤で細胞数をカウントします
   手記：この段階では、細胞の生存率も確認できます。
2. 滅菌した微量遠心チューブキャップを100mmのペトリ皿に入れ、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングされたカバースリップを鉗子を使用して、キャップの上に一度に1つずつ移します
   手記：カバーガラスを洗ったり、ラミニンを乾燥させたりすると、培養が不均一になり、細胞の生存率が低下する可能性があるため、避けてください。
3. 各カバースリップの上に完全培地と100 μl(合計150,000セル)の細胞懸濁液を加えて、容量を1 μlあたり1,500セルに調整します(カバースリップの表面をこぼさないように覆うのに最適な容量です)。シャーレを閉じ、加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で1時間インキュベートします
   手記：クリティカルステップ:このステップは、細胞の接着と生存率を高め、胚あたりのカバースリップの数を増やすために必要です。あるいは、細胞を直接ウェル(カバースリップを含む)に移すこともできますが、細胞の数はウェルあたり350,000に増やす必要があります(150,000ではなく)。言い換えれば、この方法を使用すると、8〜10枚のカバースリップを取得できますが、直接転写すると、プレートに付着するセル(カバースリップの横または下)のために約3〜4枚のカバースリップが得られます。この方法を用いた培養物の平均生存率は約90%であった。

>3. 文化の成長と維持

1. インキュベーションの1時間後、培地を含むカバーガラスを、400 μlの予備加温済み(37°Cまで)の完全培地(総容量:500 μl)が入った24ウェルプレートに慎重に移します。細胞を37°Cで一晩(O / N)インキュベートします。
2. ウェルのインキュベーション後24時間以内に、500 μlの完全培地を各ウェルに静かに加えます。
   注:最初の数時間は、ドーパミン作動性ニューロンの生存にとって最も重要な段階であり、生存する細胞の数はこの時点を超えて大きく変化しません。
3. 最初の2週間、または培地が黄色になるまで、培養物に追加の培地を追加しないでください。2週間以上培養するか、培地の色が黄色に変わった場合は、培地の半分(500μl)を温めた新鮮な完全な培地と交換してください(通常は2週間ごと)
   手記：培養物内のドーパミン作動性ニューロンは、これらの条件下で6週間以上生存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコの改変イーグル中型栄養素混合物F-12	インビトゲン	11330
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)(1X)、液体	インビトゲン	24020-117
ウシ胎児血清、発熱不活性化(FBS)	インビトゲン	16140
N2サプリメント(100X)、液体	インビトゲン	17502-048
D-(+)-グルコース溶液(45%(wt/vol)水溶液	シグマ	G8769
ウシ血清アルブミンBSA	シグマ	A9430
Engelbreth-HolmSwarmマウス肉腫基底膜由来のラミニン	シグマ	L2020
ペニシリン/ストレプトマイシン	インビトゲン	15070
トリプシン(0.05%(wt/vol)	インビトゲン	25300
ウシ血清アルブミン(BSA)細胞培養試験	シグマ	A9418の
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	P3813
ポリ-L-オルニチン、0.01%溶液	シグマ	P4957
トリパンブルー溶液(0.4%(wt/vol))	ビオウィテカー	17-942E

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