びまん性内因性橋グリオーマからの細胞の単離と培養

要約

出典:Lin, G. L. et al., びまん性内因性橋神経膠腫(DIPG)の迅速な死後細胞培養のためのプロトコル。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、びまん性内因性橋グリオーマ、またはDIPGに冒された脳幹組織からグリア前駆細胞を分離し、培養するプロセスを示しています。酵素消化によって腫瘍組織から単離されたグリア細胞は、神経基底培地で培養され、その成長と自由浮遊神経球の発達が促進されます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 組織サンプルの取得

>注:このプロトコルの重要な構成要素は、剖検の時点ですぐに開始する組織提供の適切な取り扱いを必要とします。全体的なサンプル生存率は、Post-Mortem Interval(PMI)を最小限に抑え、抗生物質/抗真菌薬を添加した適切な冷培地に組織を直ちに移し、輸送中はサンプルを湿った氷上に保持し、プロトコル全体で無菌技術を維持することに大きく依存します。

1. 寄付が差し迫っていることを通知したら、サンプル収集キットを準備してください。組織サンプルの返送に直接使用できる断熱コンテナ付きの輸送用ボックスを使用する場合は、次の材料を含めてください。
   1. 滅菌手袋、カーテン、メスなど、滅菌準備用の材料を含めます。
   2. 30 mLの輸送用メディアが入った8〜10本の滅菌50 mLコニカルチューブを、氷またはコールドパック付きの断熱容器に入れます><。 手記：標準的な細胞培養培地であればどの培地でも使用できますが、Hibernate-Aに抗生物質/抗真菌薬を添加すると、最高のサンプル生存率が得られます。
   3. 他の分析用の追加のサンプルチューブ(固定剤など)を含めます。
   4. 剖検が治験責任医師の施設で行われない場合は、腫瘍サンプルの収集方法を明確に記載した文書を含めてください。これには、無菌性の維持、サンプルチューブを湿った氷の上に保管すること、腫瘍細胞がこれらの領域に侵入することが多いため、中脳と髄質からのサンプルを含めることなどの詳細が含まれます。
2. 剖検中は無菌性を維持します。頭蓋骨内の脳は無菌であると考えてくださいので、頭蓋骨が開いたら無菌技術(手袋の交換を含む)を観察してください。皮膚や髪の毛による汚染を避けることが重要です。
3. 腫瘍を腹側(橋の「腹」、図1参照)から解剖します。滅菌メスで腫瘍から小さな1 cmの塊を切り取り、すぐに冷たい輸送用メディア(ステップ1.1.2の注を参照)に移し、濡れた氷の上に置きます。各チューブに10mLの組織を入れ、各チューブ内の組織と培地の最終量は40mLになります><。 手記：びまん性内因性橋グリオーマ(DIPG)の場合、腫瘍はびまん性に橋に浸潤し、多くの場合、脳幹の残りの部分に浸潤します。そのため、通常は橋から3〜4本のチューブ(30〜40 mLの組織)、中脳と髄質からそれぞれ1〜2本のチューブ(10〜20 mLの組織)を含む、できるだけ多くのサンプルを採取します。
4. 橋に並置された中脳と髄質からサンプルを収集します。橋には多くの腫瘍細胞が含まれていることがよくあります。
5. サンプル収集後、サンプルを断熱容器内の湿った氷の上で一晩(O / N)輸送します。凍結すると細胞が死滅するため、サンプルをドライアイスで輸送しないでください。

2. サンプル処理の準備

1. サンプル調製を開始する前に、組織培養フード、カミソリの刃、湾曲した止血剤、その他の非滅菌ツールを紫外線(UV)光の下で1時間
滅菌します。
2. フィルター溶液を調製し、滅菌します。
   1. 1.8 Mスクロース溶液を調製するには、308.07 gのスクロースを300 mLの蒸留水に溶解します。カルシウムまたはマグネシウムを含まない50 mLの10倍ハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)を加え、蒸留水を使用して総容量を500 mLにします。4°Cで保存してください。
   2. 酵素消化液を調製するには、ミンチ組織10 mLごとにカルシウムとマグネシウムを含む50 mLのHBSSを服用し、500 μL 5 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼI(最終濃度50 μg/mL)、500 μL 2.5 mg/mLコラゲナーゼI/IIおよびディスパーゼ溶液(最終濃度25 μg/mL)を添加します。 500 μL 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液。37°Cのウォーターバスで予熱した消化液。
   3. 腫瘍幹培地(TSM)ベースを調製するには、250 mL Neurobasal-A、250 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)、5 mL 100x antibiotic-antimycotic、5 mL 200 mM L-alanyl-L-glutaine dipeptide(GlutaMAX-A)、5 mL HEPESバッファー、5 mL 100 mMピルビン酸ナトリウム、および5 mL 100x MEM非必須アミノ酸を混合します。
   4. 成長因子を含む完全なTSMを調製するには、TSMベースに次のサプリメントを追加します:50x B27サプリメントマイナスビタミンA(1:50)、ヒト上皮成長因子(H-EGF、20 ng/mL)、ヒト線維芽細胞成長因子(H-FGF、20 ng/mL)、ヒト血小板由来成長因子AA(H-PDGF-AA、10 ng/mL)、ヒト血小板由来成長因子BB(H-PDGF-BB、10 ng/mL)、およびヘパリン溶液(2 μg/mL)。
3. スイングバケットローターを装備した実験室用遠心分離機を4°Cに予冷します。

3. 機械的な解離

1. 組織を高壁の100 mm x 20 mm細胞培養皿に移します。出荷時に残った培地を取り出し、10 〜 15 mLの冷培養培地と交換します。
2. 湾曲した止血器を使用してカミソリの刃をつかみ、明らかな血管や髄膜を取り除きながら組織を細かく刻みます
   手記：最終的な組織片は1 mm未満である必要があります(図2Bを参照)。
3. 組織を清潔な50mLコニカルチューブに移します。細胞培養皿を追加の5 mL冷培養培地で洗浄し、コニカルチューブに移します。必要に応じてこの洗浄ステップを繰り返して、残りの組織を移します。
4. 10 mLの血清ピペットを使用して、穏やかに(4〜5回)滴定します。大きな組織片がチューブの底に沈殿するのを待ちます。必要に応じて、サンプルを1分間(350 x g、4°C)短時間遠心分離します。
5. 機械的に解離した画分を収集します。
   1. 上清を取り除き、100 μm フィルターで「Mechanical Dissociation」とラベル付けされた新しい 50 mL コニカルチューブにろ過します。フィルターを元のコニカルチューブの上に反転させ、培地で洗浄して組織片を回収します。
   2. 「機械的解離」画分を5分間(350 x g、4°C)遠心分離します。
   3. ペレット化した「機械的解離」画分から上清を取り除き、組織を冷温培地に再懸濁します。「機械的解離」コニカルチューブに5mLを超える組織がある場合は、組織を他の50mLコニカルチューブに分割して、チューブに5mLを超える組織が含まれないようにします。.
6. 機械的に解離した画分を、ショ糖勾配遠心分離ステップ(ステップ5)まで氷上に保存します。あるいは、機械的に解離した画分は、酵素解離インキュベーション期間中にステップ5に進むことができる(ステップ4.4)。

4. 酵素解離

1. 残りの大きな組織片を含むチューブに5 mLを超える組織がある場合は、組織を他の新しい50 mL円錐形チューブに分割し、5 mLを超える組織を持つチューブがないようにします。
2. 残りの組織片を含む円錐形チューブを5分間遠心分離します(350 x g、4°C)。
3. 上清を取り除き、1 mLの組織ごとに5 mLの消化液が存在するように、予め温めた酵素消化液を追加します(例:.、5 mLの組織には25 mLの消化液)。
4. 円錐形のチューブ蓋をラボ用フィルムで密封し、ローテーター上で反応を37°Cで30分間インキュベー
トします。
5. インキュベーション後、サンプルを穏やかに粉砕します(図2Cを参照)。
   1. 10 mLの血清ピペットを使用して、サンプルを6〜8回上下にピペットします。過度の気泡の発生を避けてください。
   2. ピペットの先端に1,000 μLのピペットチップを追加し、さらに6〜8回回転させます。
   3. 残りのチャンクがチューブの底に沈殿するのを待ちます。細胞を懸濁したままの上清を100 μmフィルターで濾過し、「Enzymatic Dissociation」とラベル付けされた新しい50 mLコニカルチューブに入れ、氷上に保存します。
   4. 有意な組織片が残っている場合は、カルシウムとマグネシウムを含むHBSS10 mLをフラグメントに追加し、ステップ3.5.1と3.5.2を繰り返します。この最終溶液を100 μmフィルターで「Enzymatic Dissociation」チューブにろ過します。
6. 「Enzymatic Dissociation」チューブを5分間(350 x g、4°C)遠心分離し、ショ糖勾配遠心分離を続けます。

5. ショ糖勾配遠心分離

1. サンプルがまだ溶液中に懸濁されている場合は、5分間(350 x g、4°C)遠心分離します。
2. 上清を取り除き、カルシウムとマグネシウムを含まない20mLの冷たいHBSSに組織を再懸濁します。.コールドHBSSで合計25mLまで容量を運びます。
3. 25 mLの1.8 Mスクロース溶液をゆっくりと加え、チューブを反転させて混合します。これにより、0.9 Mのスクロース勾配が得られます。
4. ブレーキなしで10分間遠心分離します(800 x g、4°C)。遠心分離ブレーキを使用すると、グラジエントが乱れ、収率が低下します(遠心分離前後のサンプルの例については、図2Dを参照してください)。
5. ミエリンの破片とできるだけ多くのショ糖溶液を慎重に吸引します。カルシウムとマグネシウムを含まない30 mLの冷たいHBSSを加えてサンプルを洗浄し、穏やかに混合します。5分間遠心分離します(350 x g、4°C)。

6. ACK赤血球溶解

1. 洗浄上清を取り除きます。5 mLのACK溶解バッファーを加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、チューブを室温で1分間渦巻かせます。
2. カルシウムとマグネシウムを含まない30mLの冷たいHBSSを加えて溶解を急冷します。
3. 5分間遠心分離します(350 x g、4°C)。

7. 初期カルチャのメンテナンス

1. 成長因子を含む10〜15 mLの温かい完全TSMに最終細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー排除を使用して血球計算盤で生存細胞密度を定量します
   手記：生存細胞の範囲は、組織提供の状況によって大きく異なり、この初期段階では細胞の残骸が残っているため、定量化が困難な場合があります。理想的なケースでは、サンプルあたり100万個の生細胞を目標にしてください。余分な破片が残っている場合は、T175フラスコで低密度でプレートします。
2. 最終的な細胞懸濁液を新しいT75培養フラスコに移します。全体的な成長因子レベルを維持し、腫瘍細胞ニューロスフェアの発達を監視するために、1日おきに追加の成長因子をスパイクします(図2Eおよび図3を参照)。

結果

図 1.橋腫瘍の剖検サンプル。びまん性内因性橋グリオーマの死後即時の出現。腫瘍は、橋の腹面に大きくてミエリンが豊富な塊として現れます。

図 2.(A)滅菌剖検手順と湿った氷での夜間輸送を通じてサンプルを取得します。(B)左から右へ:(1行目)輸送培地中の腫瘍組織を含むチューブ。100 mm x 20 mmの細胞培養皿に新鮮な組織を保存。組織の初期ミンチ;(行2)部分的にミンチ組織;髄膜と血管の除去;みじん切りにしたティッシュペーパー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハイバネート-A	ギブコ	A12475-01
HBSSとカルシウム/マグネシウム	ギブコ	24020-117
HBSSの	コーニング	21-022-履歴書
ヘープス	ギブコ	15630から080
リベラーゼDH(コラゲナーゼ/ディスパーゼ)	ロシュ	5401054001
DNAse I	ワージントン生化学	LS002007
蔗糖	シグマ	S0389
抗生物質/抗真菌薬	ギブコ	15240-096
ニューロバサル-A	ギブコ	〒10888-022
DMEM/F12	ギブコ	11330-032
GlutaMAX-I(100倍)	ギブコ	35050-061
ピルビン酸ナトリウム(100mM)	ギブコ	11360-070
ビタミンB27サプリメントマイナスビタミンA	ギブコ	12587-010
MEM 非必須アミノ酸 (100X)	ギブコ	11140-050
ヒトPDGF-AA	シェナンドー・バイオテクノロジー	100-16
ヒトPDGF-BB	シェナンドー・バイオテクノロジー	100〜18
ヒトEGF	シェナンドー・バイオテクノロジー	100〜26
ヒトFGF	シェナンドー・バイオテクノロジー	100〜146
滅菌メスの刃	バード・ペイカー	372610
湾曲止血剤	ファインサイエンスツール	13013-14
カミソリの刃	VWRの	55411-050
100 x 20 mm細胞培養ディッシュ	コーニング	353003
滅菌鉗子	TWDトレードウィンズ	DF8988-5
滅菌ドレープ	3メートル	2037
滅菌手袋	キンバリー・クラーク	1182307
ACK溶解バッファー	ギブコ	A1049201
100ミクロンメッシュフィルター	漁夫	352360
50 mLコニカルチューブ	漁夫	1495949Aさん

年