脊髄神経前駆細胞の運動ニューロンへの分化

要約

出典:Taga, A. et al., Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、脊髄神経前駆細胞(NPC)を運動ニューロンに分化させる方法を紹介しています。これは、NPCの成熟運動ニューロンへの分化を促進することを目的とした特定の阻害剤が豊富な特殊な培地を使用して、コーティングされた培養プレート上でのNPCの培養プロセスを詳述しています。

プロトコル

1. 神経前駆細胞(NPC)培養の解凍

1. 細胞を解凍する前日に、10 cmプレートにポリオルニチン(PLO)とラミニンをコーティングします。
   1. 100 μg/mLに希釈したPLOをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または蒸留水(dH₂O)でプレートに加えます。37°Cで最低1時間、一晩インキュベートします。
   2. PLO溶液を吸引し、プレートをPBSで3回すすぎます。(PLOは適切に洗浄しないと有毒です。
   3. PBSで10 μg/mLの濃度に希釈したラミニンをPLOコーティングプレートに加えます。37°Cで最低1時間、できれば一晩インキュベートします。インキュベーション後、すすぎをせずにラミニン溶液を吸引して細胞接着を促進します.
      手記：プレートは事前にPLOでコーティングし、水で3回洗浄し、滅菌フードで乾燥させ、4°Cで保存することができます。
2. 10 cmの細胞培養プレートごとに、6 x 10⁶細胞/バイアルを含むNPCバイアル1本を解凍します。
3. NPCクライオチューブを液体窒素から取り出し、すぐに37°Cのウォーターバスに最大2分間入れます。バイアルを振って、液体に囲まれた小さな氷片ができるまですばやく解凍します。
4. 1000 μLピペットを使用して細胞凝集体を15 mLコニカルチューブに移し、最大15 mLの予熱済み神経分化培地(NDM)またはダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)/ハムのF21 F12サプリメントを加えて、ジメチルスルホキシド(DMSO)を希釈します。
5. 300 x gで5分間遠心分離します。
6. 上清を吸引し、運動ニューロン(MN)分化培地(表1)+ROCK-I(20μM)で細胞ペレットを再懸濁し、1000μLピペットを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで上下に滴定します(最大5回)。
7. シングルセル懸濁液をPLO-Lamininコーティングされた10cmプレートに移します。
8. プレートをインキュベーターに移し、細胞の適切な接着を可能にするために一晩放置
します

2. 脊髄NPCの運動ニューロンへの分化

1. ステップ1.1-1.8で述べたように最初のステップを実行し、最終的な媒体はMN分化媒体+ ROCK-I(20μM)です。
2. めっきの翌日は、ROCK-Iを使わずにMN分化培地と培地を完全交換し、その後は1日おきに培地を交換してください。週末には、金曜日に細胞に栄養を与え、その後月曜日に再び細胞に栄養を与えます。細胞の破片を取り除くために、必要に応じてPBSで細胞をすすぎます。
3. MN分化培地+シトシンアラビノシド(ARA-C)(0.02 μM)で培地を交換し、グリアコミット前駆細胞が細胞クラスターに凝集した有糸分裂後MN前駆細胞の下で単一増殖フラット細胞として出現したら、48時間インキュベートします
   手記：通常、これは最初のプレーティング後最初の7日以内に発生しますが、細胞株によってはばらつきがある場合があります。
4. 48時間後、ARA-Cを含む培地を吸引し、PBSで培養物を3回穏やかにすすぎ、培地をARA-Cを含まない新鮮なMN培地に交換します。
5. ARA-Cによる治療後、神経細胞クラスターの早期剥離を防ぐために、真空吸引器ではなく手動ピペットで古い培地を取り出して、隔日(または月曜日、水曜日、金曜日)に培地交換を行います。さらに、週に一度、MN培地をラミニン1 μg/mLで濃縮し、培養プレートへのニューロンの接着をさらに強化します。

表1:培養メディア

ミディアムネーム	試薬	濃度
神経分化培地(NDM)	ニューロベースル L-グルタミン 非必須アミノ酸 サプリメント N - N2 サプリメント ペニシリン/ストレプトマイシン	1x 100倍 100倍 100倍 100倍
運動ニューロン分化媒体	神経分化媒体 アスコルビン酸 プロモルファミン 脳由来神経栄養因子 毛様体神経栄養因子 インスリン様成長因子 1 グリア細胞株由来神経栄養因子 レチノイン酸 コンパウンドE サプリメントB - B27 サプリメント	1x 0.4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50倍

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm滅菌培養プレート	隼	353003
非必須アミノ酸(NEAA)	サーモフィッシャー	11140050	作業集中力 100倍
サプリメント N - N2 サプリメント	サーモフィッシャー	17502048	作業集中力 100倍
L-グルタミン	サーモフィッシャー	25030	作業集中力 100倍
神経基礎	サーモフィッシャー	21103049	作業集中力 1x
レチノイン酸(RA)	シグマ	R2625	100 mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMの原液を得ます。ストック100μL/チューブを分注し、-80°Cで凍結します。200 μLの100 mMストックを取り、10倍に希釈(1.8 mLのDMSOを添加)して10 mMストックを調製します。50 μL/チューブを分量し、-80°Cで保存し、1:10000で希釈して使用してください。(作業濃度2μM)。
ポリオルニチン(PLO)	シグマ・アルドリッチ	P3655	100 mgを1 mLのddWに溶解して、100 mg/mLのストック溶液を得ます。ストックを100 μLチューブに分注します。(使用濃度 100 μg/mL)
ラミニン	サーモフィッシャー	23017-015	原液 1 mg/mL、使用濃度 10 μg/mL (コーティング)、1 μg/mL (細胞培地)
アスコルビン酸(ASAC)	シグマ	A4403の	100 mgを250 mLのdH2Oに溶解して、0.4 mg / mlのストックを得ます。.0.22 μmフィルターを通して滅菌フィルターを滅菌し、-80°Cで凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度0.4μg/ mL)。
毛様体神経栄養因子(CNTF)	ペプロテック	450から13	100 μgを1 mLの滅菌PBSに溶解し、9 mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 μg / mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
コンパウンドE	アブカム	ab142164	250 μgを2.0387 mLのDMSOに溶解して、250 μMのストックを得ます。-80°Cでアリコートして凍結し、1:2000に希釈して使用します。(作業濃度125 nM)。
DMEM/F12	サーモフィッシャー	113300	作業集中力 1x
グリア細胞株由来神経栄養(GDNF)	ペプロテック	450から10	100 μgを1 mLのPBSに溶解して100 μg / mLにした後、9 mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 μg / mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
ROCK-I阻害剤	ペプロテック	1293823	5 mgを1480 μLのdH2Oに溶解して10 mMのストックを取得し、分注して-80°Cで凍結します。1:500で希釈して使用します。(使用濃度20μM)。
ペンシルリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	作業集中力 100倍
プルモルファミン(PMN)	ミリポアシグマ	540223	5 mgを9.6 mLのDMSOに溶解して、1 mM溶液を得ます。分注して-80°Cで凍結し、1:1000に希釈して使用します。(作業濃度1μM)。
組換えヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)	ペプロテック	450から02	再構成する前に短時間遠心分離します。100 μgを1 mLのPBSに溶解して100 μg/mLにした後、9 mLの滅菌0.1% BSA-PBSを10 μg/mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
インスリン様成長因子1(IGF-1)	研究開発体制	291-G1-200	2 mLのPBSに200 μgを溶解し、100 μg/mLに溶解し、次に0.1%BSA-PBSの18 mLを加えて10 μg/mLのストックを作成し、-80°Cで保存します。分注して-80°Cで凍結します。10 μg/mLのストックを1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
グリア細胞株由来神経栄養(GDNF)	ペプロテック	450から10	100 μgを1 mLのPBSに溶解して100 μg / mLにした後、9 mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 μg / mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
レチノイン酸(RA)	シグマ	R2625	100 mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMの原液を得ます。ストック100μL/チューブを分注し、-80°Cで凍結します。200 μLの100 mMストックを取り、10倍に希釈(1.8 mLのDMSOを添加)して10 mMストックを調製します。50 μL/チューブを分量し、-80°Cで保存し、1:10000で希釈して使用してください。(作業濃度2μM)。
コンパウンドE	アブカム	ab142164	250 μgを2.0387 mLのDMSOに溶解して、250 μMのストックを得ます。-80°Cでアリコートして凍結し、1:2000に希釈して使用します。(作業濃度125 nM)。
サプリメントB - B27 サプリメント	サーモフィッシャー	21985023	作業集中力50倍
無菌細胞培養フード	ベイカーカンパニー	SG-600
卓上細胞培養遠心分離機	サーモフィッシャー	75004261	ソルバルレジェンドX1R
ウォーターバス	サーモフィッシャー	2332	アイソテンプ
湿度制御細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー	370	37ºC、5%CO2に設定

名 名