マウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞の単離と培養

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 事前準備

1. CGNP(小脳顆粒ニューロン前駆細胞)単離のための調製物
   1. マウスの適切な交配を組織して、小脳を分離するためのP5-P7動物を生成します(ChIPおよび条件ごとに3-5匹)。
   2. HBSSバッファーに6 mg / mLグルコースを添加して、HBSS /グルコースを調製します。
   3. 1 % (v/v) N2 サプリメント、1 % (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン、25 mM KCl、および 10 % FCS を DMEM-F12 に添加して、CGNP 細胞培養培地 (CGM) を調製します。CGNP培養では、FCSを含まないCGM培地を調製し、0.6 μg/mLのソニックヘッジホッグ(SHH)(CGM-SHH)を含め、必要に応じて37°Cに平衡化します。
   4. 6ウェル細胞培養プレートに100 μg/mLのポリ-D-リジンを室温で1〜2時間塗布し、グリア細胞を除去します。その後、滅菌ddH₂Oで2回洗浄し、プレートを乾燥させます。プレートは4°Cで最大1週間保管してください。
   5. CGNPを培養するには、6ウェル細胞培養プレートをポリ-L-オルニチン(0.1 mg/mL)で4°Cで一晩コーティングします。その後、細胞培養のためにH₂Oで2回洗浄し、プレートを乾燥させます
      手記：プレートは4°Cで最大1週間保存できます。
   6. HBSS/グルコースで0.025%トリプシン(w / v)を調製し、必要に応じて37°Cに平衡化します。
2. 脳組織の神経前駆細胞の分離
   1. CGNP(小脳顆粒ニューロン前駆細胞)の単離とオプション培養
      1. はさみを使用して斬首することにより、P5-7動物を安楽死させます。頭皮の皮膚を切除し、頭蓋骨を開き、小さなハサミと鉗子を使用して脳を切除します。小脳を分離し、氷冷したHBSS /グルコースに移します。すべての髄膜と血管を切除し、小脳を冷たいHBSS /グルコースで満たされた15mLのチューブに移します。
      2. 10mLの氷冷HBSS /グルコースで小脳を3回洗浄し(650 x gで4°Cで5分間遠心分離して収集)、続いて1mLピペットで穏やかにピペッティングして小脳を均質化します(最大2〜3回)0.5〜1 mm³フラグメントを取得します。
      3. HBSS/Glucoseに0.025%トリプシンの5 mLを加え、37 °Cの水浴で15分間絶えず攪拌しながら組織をインキュベートします。CGMの5 mLを加えて消化を停止し、650 x gで4 °Cで5分間遠心分離して組織を収集します。
      4. 上清を取り除き、1 mL CGM に 1 mL ピペットチップで組織を滴定し、新しい 15 mL チューブに移します><。 手記： 気泡を避けることが重要です。
         1. 5 mLのCGMを加え、混合物を氷上で2分間インキュベートして、組織の残骸を沈殿させます。上清を新しい15mLチューブに移します。2 mLのCGMを残存組織に加え、トリチュレーション手順を繰り返します。
      5. 上清(組織残骸なし、合計約10mL)をプールし、650 x gで4°Cで5分間遠心分離して、小脳細胞を回収します。ペレットを10mLのCGMに再懸濁します。
      6. アストロサイトはCGNPよりもポリD-リジンに速く強く接着するため、100 μg/mLのポリD-リジンコーティングされた6ウェルプレート(ウェルあたり最大4 mL)に細胞をプレート化し、37°Cで20分間インキュベートしてアストロサイトを除去します。
      7. プレートを振って上澄みを回収します。次に、15 mLチューブ内で650 x g、4°C、5分間遠心分離します。ペレットを10 mL CGMに再懸濁し、ノイバウアー計数チャンバーで細胞をカウントします
         手記：CGNPは丸く小さく、位相差顕微鏡を使用して画像化するとハローを示します。
      8. 必要に応じて、ポリ-L-オルニチンコーティングプレート(3 x 10⁶細胞/6ウェル)上の37°C予温CGMで細胞を播種し、37°C、5%_CO2、100%相対湿度でインキュベートします
         手記：CGMをプレート上に残すと(そしてそれとともにFBS)、CGNPは小脳顆粒ニューロン(CGN)に分化します。