マウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞の単離と培養

要約

出典:Bovio, P., et al., Isolation and Cultivation of Neural Progenators Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、マウスの子犬の小脳から小脳神経前駆細胞の分離と培養を示しています。小脳顆粒ニューロン前駆細胞は、接着差によって単離および精製され、アストロサイトを効果的に除去します。これらの培養された前駆細胞は、その後、小脳顆粒ニューロンに分化します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 事前準備

1. CGNP(小脳顆粒ニューロン前駆細胞)単離のための調製物
   1. マウスの適切な交配を組織して、小脳を分離するためのP5-P7動物を生成します(ChIPおよび条件ごとに3-5匹)。
   2. HBSSバッファーに6 mg / mLグルコースを添加して、HBSS /グルコースを調製します。
   3. 1 % (v/v) N2 サプリメント、1 % (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン、25 mM KCl、および 10 % FCS を DMEM-F12 に添加して、CGNP 細胞培養培地 (CGM) を調製します。CGNP培養では、FCSを含まないCGM培地を調製し、0.6 μg/mLのソニックヘッジホッグ(SHH)(CGM-SHH)を含め、必要に応じて37°Cに平衡化します。
   4. 6ウェル細胞培養プレートに100 μg/mLのポリ-D-リジンを室温で1〜2時間塗布し、グリア細胞を除去します。その後、滅菌ddH₂Oで2回洗浄し、プレートを乾燥させます。プレートは4°Cで最大1週間保管してください。
   5. CGNPを培養するには、6ウェル細胞培養プレートをポリ-L-オルニチン(0.1 mg/mL)で4°Cで一晩コーティングします。その後、細胞培養のためにH₂Oで2回洗浄し、プレートを乾燥させます
      手記：プレートは4°Cで最大1週間保存できます。
   6. HBSS/グルコースで0.025%トリプシン(w / v)を調製し、必要に応じて37°Cに平衡化します。
2. 脳組織の神経前駆細胞の分離
   1. CGNP(小脳顆粒ニューロン前駆細胞)の単離とオプション培養
      1. はさみを使用して斬首することにより、P5-7動物を安楽死させます。頭皮の皮膚を切除し、頭蓋骨を開き、小さなハサミと鉗子を使用して脳を切除します。小脳を分離し、氷冷したHBSS /グルコースに移します。すべての髄膜と血管を切除し、小脳を冷たいHBSS /グルコースで満たされた15mLのチューブに移します。
      2. 10mLの氷冷HBSS /グルコースで小脳を3回洗浄し(650 x gで4°Cで5分間遠心分離して収集)、続いて1mLピペットで穏やかにピペッティングして小脳を均質化します(最大2〜3回)0.5〜1 mm³フラグメントを取得します。
      3. HBSS/Glucoseに0.025%トリプシンの5 mLを加え、37 °Cの水浴で15分間絶えず攪拌しながら組織をインキュベートします。CGMの5 mLを加えて消化を停止し、650 x gで4 °Cで5分間遠心分離して組織を収集します。
      4. 上清を取り除き、1 mL CGM に 1 mL ピペットチップで組織を滴定し、新しい 15 mL チューブに移します><。 手記： 気泡を避けることが重要です。
         1. 5 mLのCGMを加え、混合物を氷上で2分間インキュベートして、組織の残骸を沈殿させます。上清を新しい15mLチューブに移します。2 mLのCGMを残存組織に加え、トリチュレーション手順を繰り返します。
      5. 上清(組織残骸なし、合計約10mL)をプールし、650 x gで4°Cで5分間遠心分離して、小脳細胞を回収します。ペレットを10mLのCGMに再懸濁します。
      6. アストロサイトはCGNPよりもポリD-リジンに速く強く接着するため、100 μg/mLのポリD-リジンコーティングされた6ウェルプレート(ウェルあたり最大4 mL)に細胞をプレート化し、37°Cで20分間インキュベートしてアストロサイトを除去します。
      7. プレートを振って上澄みを回収します。次に、15 mLチューブ内で650 x g、4°C、5分間遠心分離します。ペレットを10 mL CGMに再懸濁し、ノイバウアー計数チャンバーで細胞をカウントします
         手記：CGNPは丸く小さく、位相差顕微鏡を使用して画像化するとハローを示します。
      8. 必要に応じて、ポリ-L-オルニチンコーティングプレート(3 x 10⁶細胞/6ウェル)上の37°C予温CGMで細胞を播種し、37°C、5%_CO2、100%相対湿度でインキュベートします
         手記：CGMをプレート上に残すと(そしてそれとともにFBS)、CGNPは小脳顆粒ニューロン(CGN)に分化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント(50x)	ライフテクノロジー	17504044	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント: CCM の場合
DMEM-F12	ライフテクノロジー	〒11320-033	カテゴリー: 細胞培養 略語・コメント:CGM用
ウシ胎児血清 10% (v/v)	ギブコ	10082147	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:CPCアイソレーションとCGM用
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G5767	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:CGNP分離用
グルタチオン(1.25 mg / ml)	シグマ・アルドリッチ	G4251	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント: CCM の場合
グリシン	カール・ロス	3187	カテゴリー: ChIP 略語/コメント:細胞固定用
ハンクのバランスの取れた塩溶液	ライフテクノロジー	14025から100	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:HBSS
L-グルタミン (200 mM)	ライフテクノロジー	25030081	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント: CCM の場合
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020	カテゴリー: 細胞培養 略語・コメント:CPC培養用
N2サプリメント	ライフテクノロジー	17502048	カテゴリー: 細胞培養 略語・コメント:CGM用
神経基礎媒体	ギブコ	21103049	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント: CCM の場合
ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン1%(v / v)	ライフテクノロジー	15640055	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:PSN、CCMおよびCGMの略
リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジー	10010023	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:PBS、CPC分離
ポリ-D-リジン	シグマ・アルドリッチ	P6407	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:CGNP分離用
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P3655	カテゴリー: 細胞培養 略語・コメント:CPC培養用
塩化カリウム	サーモフィッシャー	AM9640G	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:KCl、CGM用
ソニックヘッジホック(SHH)	シグマ・アルドリッチ	SRP6004	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:CGNP分離用
スーパーオキシドジスムターゼ(1mg / ml)	シグマ・アルドリッチ	S7571	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント: CCM の場合
トリプシン-EDTA 0.05% (w/v)	シグマ・アルドリッチ	59417C	カテゴリー: 細胞培養 略語/コメント:CPC分離用

の 名 の 型 型