ヒト多能性幹細胞からのスフェロイドの作製

要約

出典:Shaker, M. R., et al. Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)の球状脳オルガノイドへの変換を示しています。特異的な阻害剤を用いることで、hPSCは神経細胞の系統に分化するように誘導され、神経外胚葉コロニーを形成します。その後、特別な成長因子が導入され、コロニーの自己組織化と増殖が促進され、最終的には球状の脳オルガノイドが形成されます。

プロトコル

1. 皮質脳オルガノイドの生成(図1)

>注:プロトコルのこのセクションのすべてのステップは、特に明記されていない限り、クラス2バイオセーフティフードで行われます。

1. ヒト多能性幹細胞(hPSC)からの2D神経外胚葉コロニーの誘導2D培養(-1〜3日目)
   1. 誘導する前に、ヒト胚性幹細胞(hESC)認定の基底膜マトリックスにhPSCコロニーを20%〜30%の密度で6ウェルプレートに播種します。この密度を達成するには、60%コンフルエントの6ウェルプレートの1ウェルから6ウェルプレートの3ウェルにhPSCコロニーを継代します。
   2. 基底膜マトリックスコーティングの場合、基底膜マトリックスをプレーンな基礎媒体で1:50の比率で希釈します。6ウェルプレートの1 mL/ウェルを均一に沈殿させ、室温(RT)で1時間インキュベートした後、吸引します。
   3. 分化前に、無血清細胞培養培地2 mLでhPSCコロニーを1日間維持します。
   4. hPSCの分化の日には、4倍から10倍の倍率で明視野顕微鏡を使用してhPSCコロニーを検査し、検出可能な分化がない健康なコロニーを確認します
      手記：健康なhPSCは、大きな核、非常に小さな細胞質、および目立つ核小体を持つ細胞とタイトエッジコロニーを形成します。分化したiPSCコロニーは、特にコロニーの外縁周辺または中心で、上記のhPSCコロニーと明確な形態学的違いを示します。
   5. 表1に示す試薬を添加して、分化に必要なN2培地を調製します。使用前にこの培地をRTに持って行きます。
   6. RTにしたら、6ウェルプレートの各ウェルから無血清細胞培養培地を吸引し、5 mLの血清ピペットで穏やかに添加した2 mLのN2培地と交換します。
   7. デカペンタプレッグ(SMAD)阻害剤、SB-431542(10μM)およびLDN 193189(100 nM)に対する母親のデュアルサプレッサーを追加します。
      手記：SMAD阻害剤は、培地を各ウェルに入れた後にN2培地に添加することも、無血清細胞培養培地を置き換える前に必要な量のN2培地に添加することもできます。阻害剤は、プレートを穏やかに渦巻かせるか、培地と阻害剤を含むチューブを3〜4回反転させることにより、培地に均一に組み込むことができます。
   8. SB-431542(10 μM)およびLDN 193189(100 nM)を添加した新鮮なN2培地を、次の2日間、各ウェルに毎日追加します
      手記：SB-431542およびLDN 193189化合物を溶解し、細胞毒性を予防するために使用されるジメチルスルホキシド(DMSO)への細胞の長期曝露を減らすために、新鮮なN2培地を添加します。
2. 誘導された2D神経外胚葉コロニーからの3D神経外胚葉スフェロイドの生成(3日目から7日目)
   1. ステップ1.2.2-1.2.8に従ってdispaseを使用して、誘導された神経外胚葉コロニーを持ち上げます。
   2. まず、2 mLのN2培地を6ウェルプレートから取り出し、HBSSで1回洗浄して、すべてのN2培地が除去されていることを確認します
      手記：N2培地は、ディスパーゼの酵素活性を妨害し、ウェルからの神経外胚葉コロニーの適切な剥離を妨げる可能性があります。
   3. 2.4 unit/mL dispase 1 mL を各コロニー含有ウェルに加えます。
   4. ウェルを37°Cで20〜25分(最大30分)インキュベートします。コロニーの剥離を定期的にチェックしてください
      手記：小さなコロニーは20分以内に分離することがあります。30分経過しても立ち往生しているコロニーは無視してください。
   5. インキュベーション後、1 mLのN2培地をウェルに加えてディスパーゼ酵素の活性を停止し、広口径のP1000ピペットチップまたは滅菌ハサミでカットした改良型P1000ピペットチップを使用してコロニーを15 mLチューブに移します(広口径のP1000チップになります)。
   6. コロニーの塊が重力でチューブの底に沈むのを待ちます.
      手記：このプロセスには約1分かかります。
   7. 塊が沈んだら、標準のP1000ピペットチップで上清を慎重に取り除き、1 mLの新しいN2培地と交換します。この洗浄ステップを3回繰り返して、ディスパーゼを完全に除去します.
      手記：残っているディスパーゼは、神経外胚葉スフェロイドの均一な形成を防ぎ、細胞死を誘発します。
   8. 洗浄後、細胞塊を3 mLのN2培地に再懸濁し、6ウェルプレートの1ウェルに移し、40 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を加えます
      手記： 多数の神経外胚葉コロニーが剥離した場合、これらのコロニーを6ウェルプレートの2つ以上のウェルに播種して、スフェロイドの融合を防ぐことができる。コロニーのディスパーゼ剥離の24時間後、スフェロイドが形成されたかどうかを確認します。
   9. スフェロイドを次の3〜4日間同じ培地に保持しますが、神経外胚葉細胞の増殖を促進し、自己組織化し、神経上皮を誘導および拡大するために、毎日各ウェルに新鮮なbFGF(40 ng / mL)を追加します><。 手記：スフェロイドを高密度で播種すると、培地が黄色に変わる可能性が高く、2日ごとに新しいbFGF(40 ng/mL)と交換する必要があります。ただし、これは推奨されず、代わりに、この問題を回避するために、各ウェルで維持するスフェロイドの数を減らす必要があります。スフェロイドは、神経上皮が明らかな場合、3日後に基底膜マトリックスに埋め込むことができます。神経上皮が明らかでない、または強く見えない場合は、スフェロイドを別の日維持し、再度確認してください。

>表 1: N2 中程度。この表は、N2培地の調製に必要な試薬を示しています。

メディアコンポーネント	濃度
DMEMニュートリエントミックスF12 10x 500 mL(DMEM/F-12)
N2サプリメント 5 mL (100x)	1%で供給
B 27サプリメント10 mL	2%で補充
MEM非必須アミノ酸溶液(100x)	1%で補充
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	1%で補充
2-メルカプトエタノール 50mL(1000x )	0.1%で補足

結果

図1:再現可能な皮質脳オルガノイドを生成するための概略図。 フィーダーフリー培地に保持されたhPSCから皮質脳オルガノイドを作製するための実験手順の概略ワークフロー。このワークフローでは、オルガノイドで2D hPSCを3Dパターン化された皮質プレートヒト組織に区別するための6つのステップの概要を説明します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16%ホルムアルデヒド(W / V)メタノールフリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28908	PFAの4%を1x PBSで希釈
2-メルカプトエタノール 50mL(1000x)	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア(TFS)	21985023	NMおよびDMメディアで使用されます
B 27サプリメント10 mL	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア(TFS)	17504044	NMおよびDMメディアで使用されます
SC50カメラ付きCKX53顕微鏡	オリンポス
Corning Costar 6 ウェル細胞培養プレート	シグマアルドリッチPty株式会社	CLS3516-50EA
ディスパーゼIIパウダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17105041	粉末をHBSSに溶解し、0.22μmフィルターでろ過し、10mLで分注し、-20°Cで保存
DMEMニュートリエントミックスF12 10x 500 mL(DMEM/F-12)	サーモフィッシャー	11320082	NMおよびDMメディアで使用されます
DMSOジメチルスルホキシド	シグマアルドリッチPty株式会社	D2650-100ミリリットル
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	シグマアルドリッチPty株式会社	D1408-500ミリリットル
Falcon Matrigel hESC認定マトリックス	インビトロテクノロジーズ社	FAL354277	100 μLの分注を作成し、-20°Cで保存
GlutaMAX サプリメント 100倍	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061	NMおよびDMメディアで使用されます
ハンクスバランスソルトソリューション	シグマアルドリッチPty株式会社	H8264-J
ヒト人工多能性幹細胞(EU79)			皮膚線維芽細胞からの社内レポログラム
ヒト人工多能性幹細胞(G22)	Genea バイオセル		Genea Biocells(米国サンディエゴ)から取得
ヒト人工多能性幹細胞(WTC)			ブルース・コンクリン教授からの贈り物
InSolution TGF-Β RIキナーゼ阻害剤VI号、SB431542	メルク	US1616464-5MG
インスリン溶液ヒト組換え体	シグマアルドリッチPty株式会社	I9278	NMおよびDMメディアで使用されます
LDN193189 二塩酸塩	シグマアルドリッチPty株式会社	SML0559-5MG	微分時に使用されます
MEM非必須アミノ酸溶液(100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140050	NMおよびDMメディアで使用されます
mTeSRプラス	STEMCELLテクノロジー	〒100-0276	NM培地と分化する前にhiPSCコロニーを維持するために使用
N2サプリメント 5 mL (100x)	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	17502048	NMおよびDMメディアで使用されます
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	NMおよびDMメディアで使用されます
組換えヒトFGF基本	R&Dシステム	233-FB-01M	アリコートは20 μg/mLで製造され、-20°Cで保存されます
SB431542	トクリス	1614	微分時に使用されます
超低接着マルチウェルプレート、24ウェルプレート、ポリスチレン	シグマアルドリッチPty株式会社	CLS3473-24EA

します します の 年