マイクロ流体共培養システムを用いた歯胚芽と三叉神経節の相互作用の解析

要約

出典:Pagella, P., et al.マイクロ流体共培養デバイスを使用した歯の胚芽神経支配の発達の解析。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、歯の胚芽パルプと三叉神経節の間の相互作用を研究するためのマイクロ流体デバイスの使用を示しています。マイクロ流体デバイス内の組織の配置を示し、デバイスのマイクログルーブを介して歯の胚芽に向かっている三叉神経突起の成長を詳細に視覚化します。さらに、歯の胚芽髄への神経突起伸展を促進または阻害する歯由来の分子因子の役割を強調しており、これは出生後の効率的な歯の神経支配を確保するために重要です。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 解剖材料、培地、マイクロ流体デバイスの調製

1. オートクレーブマイクロダイセクション鉗子とハサミ(121°C、滅菌時間:20分)を滅菌容器に保管します。
2. ガラスカバースリップ(24 mm x 24 mm)を1 M HClで37 °Cのオービタルシェーカーで24時間インキュベートして滅菌し、滅菌済みの蒸留H₂Oで3回、エタノール99%で3回洗浄します。次に、カバーガラスを37°Cまたは滅菌フローフードの下で乾燥させます。最後に、オートクレーブ処理を行うか、カバーガラスをUV光にさらして(30分)、滅菌を完了します。その後、カバーガラスをエタノール70%で保存することができます。
3. 滅菌鉗子を使用して、AXIS Axon Isolation Devicesをパッケージから慎重に取り出し、滅菌ペトリ皿に入れます。
4. 滅菌生検パンチ(ø:1mm)を使用して、培養チャンバーに対応して培養するサンプル(図1)ごとに1つの穴を作成します
   手記： マイクログルーブに近づきすぎると、圧力によって損傷する可能性があるため、パンチしないでください。
5. AXIS Axon Isolation Devicesをエタノールに70%浸して滅菌します。次に、AXIS Axon Isolation Devicesとカバースリップを滅菌フローフードの下で完全に乾燥させます。3時間以上待ってから進めてください.
   手記： 乾燥が不完全であると、マイクロ流体デバイスの組み立てに欠陥が生じます。
6. 各カバースリップを35 mmのシャーレまたは6ウェルプレート内のウェルに入れます。
7. AXIS Axon Isolation Deviceをカバースリップに置き、端が曲がった鉗子で優しくしっかりと押して、アイソレーションデバイスとガラスカバースリップが完全に接着できるようにします。
8. 各培養チャンバーで、150 μlのポリ-D-リジン (滅菌蒸留H₂O中0.1 mg/mL) をピペットで保存します。マイクロ流体デバイスを真空下に5分間置き、培養チャンバーからすべての空気を取り除きます。
9. チャンバー内にまだ空気が見える場合は、ポリD-リジン溶液をチャンバーに再ピペットで移します。
10. デバイスをポリ-D-リジンO/Nと37°Cでインキュベートします。
11. 滅菌した蒸留H₂Oでチャンバーを3回洗浄します。
12. 150 μLのラミニンワーキング溶液(Sigma-Aldrich、5 μg/ml、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または無血清培地)をチャンバーに充填し、O/Nを37°Cでインキュベー
トします。
13. 次の組成で三叉神経節培養用の培地50 mlを準備します:48 ml神経基礎培地、1 ml B-27、100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、5 ng / ml神経成長因子(NGF)、0.25 pMシトシンアラビノシド。
14. 次の組成で歯の胚芽培養用の培地50 mlを準備します:40 mlのダルベッコ修正イーグルス培地(DMEM)-F12、10 mlのウシ胎児血清(FBS、最終濃度:20%)、100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、150 μg / mlアスコルビン酸。.

2. マウス胚の生成と解剖

1. 膣プラグ(膣プラグ:発生日0.5、E0.5)に基づいて胚年齢を決定し、形態学的基準で確認します。このプロトコルでは、通常、E14.5-E17.5マウス胚を使用します。
2. 解剖領域とステレオスコープをエタノール70%で洗浄します。
3. 子宮頸部脱臼によって妊娠中の母親を犠牲にします。マウスの首をグリッド上の1本目と2本目の指の間に置き、テールをしっかりと引っ張ります。
4. 下腹部周辺の皮膚を解剖し、ハサミで腹部を開きます。子宮の位置を特定する:妊娠後期には、子宮は腹腔内を豊富に満たします。
5. 子宮を解剖し、氷の上にPBSを充填したチューブに入れます。氷上では、組織を数時間放置することができます。母親の死体は、施設のガイドラインに従って廃棄してください。
6. 子宮から胚を解剖し、胚体外組織から解放します。胚を氷上のPBSに置きます。
7. ハサミを使用して胚の首を切り落とし、マイクロ解剖ハサミを使用して下顎を頭の残りの部分から分離します(図2A)。三叉神経節を損傷することなく、下顎を正確に取り外します。後者は下顎のすぐ近くに局在しているため、偶発的な損傷が発生する可能性があります。下顎と頭の残りの部分を氷の上で冷たいPBSで保存します。
8. 三叉神経節(TG)を解剖するには、頭部を取り、以前に冷たいPBSで満たされた解剖ガラスのペトリ皿に置きます。鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を取り除きます。次に、鉗子を終脳の下に置き、持ち上げて、終脳と小脳を取り除きます。終脳と小脳は一緒に反転し、頭蓋骨の底が露出したままになります。
9. 三叉神経節を局在化します(図2B)。鉗子を使用して、TGを三叉神経から分離します。解剖針をナイフとして使用して、三叉神経突起の残骸を排除します。解剖したTGを冷たいPBSで満たされたシャーレに入れ、氷の上に保ちます。
10. 胚歯を解剖するには、以前に頭蓋骨から分離した下顎を、冷たいPBSで満たされた解剖ガラスのペトリ皿に置きます。解剖針をナイフとして使用して、舌と顎の周囲の皮膚を取り除きます。顎の正中線に沿って切断することにより、左右の半顎を分離します。歯の細菌は、図2Cに示すように簡単に見ることができます。解剖針を使用して歯の細菌を分離し、余分な歯以外の組織を取り除きます。解剖した歯の細菌を冷たいPBSで満たされたシャーレに入れ、氷の上に置きます。

3. マイクロ流体共培養

1. 解剖後、マイクロ流体デバイスからラミニンを除去します。チャンバーに200 μlのそれぞれの培地を充填します。
2. 鉗子を使用して、解剖したTGと歯の細菌を、パンチングによってできた穴にそっと移します(図2D)。歯の細菌が浮かばないようにし、カバーガラスに接触するまで沈むことを確認してください。
3. インキュベーターでサンプルを37°C、5%CO₂で培養します。
4. 培地は48時間ごとに交換してください。チャンバーを完全に空にしたり、培養チャンバーに直接ピペットで入れたりしないでください。
   チャンバーを完全に空にすると、チャンバー内に気泡が形成されます。チャンバーに直接ピペッティングすると、軸索が損傷します。これらの問題を回避するには、ピペットをウェルの外側に向けて培地を取り外します。同様に、チャンバーの反対側にあるウェルの側面に新鮮な培地をピペットで移します。
5. 共培養は、培養期間中にタイムラプス顕微鏡で簡単に画像化でき、10日間以上維持することができます。
6. 培養期間終了後、150 μlのPBSを1つのチャンバーにつき1ウェルにピペットで移し、PBSをチャンバー内に3回流してチャンバーを洗浄します。
7. PBSを取り出し、1チャンバーにつき1ウェルに150 μlのパラホルムアルデヒド4%(PBS中)をピペッティングしてサンプルを固定し、室温で15分間インキュベートします。3.6で説明したように、チャンバーをPBSで2回洗浄します。
8. さらに分析を進めます。

結果

図 1. 搭載されたマイクロ流体共培養装置(A)を上から見た図。(B)部分的に横方向。培養室(cc)は赤(eosin)と青(トルイジンブルー)で強調表示されています。マイクログルーブ(mg)は、培養室の間の白い線として見ることができます。神経節と共培養された臓器/組織は、デバイスのパンチ穴(ph)を介して適切な培養チャンバーに配置されます。培地はウェル(mw)を介して追加および除去されます。

図 2.(A

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AXIS Axon Isolation Devices(軸索アイソレーションデバイス)	ミリポア	AX15010-TC	さまざまな長さのマイクロチャネルが利用可能です
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020
神経基礎	ギブコ	21103-049
B27	ギブコ	17504
組換えマウスβ-NGF	R&Dシステム	1156-NG-100	ヒトとラットのβ-NGF(R&Dシステム)は同等です
DMEM-F12	ギブコ	〒11320-033