コンパートメント化されたマイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞のニューロンへの分化

要約

出典: Paranjape, S. R., et al. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、マイクログルーブバリアによって分離された体細胞と軸索コンパートメントで構成されるマイクロ流体デバイスを使用して、神経幹細胞(NSC)の分化を示しています。NSCは体細胞コンパートメントに導入され、接着することができます。NSCは体細胞コンパートメント内でニューロンに分化し、微小溝バリアを介して軸索コンパートメントに軸索を伸ばします。

プロトコル

>注:図1A、Bは、メインチャネルまたはコンパートメント、ウェル、およびマイクログルーブの位置を含む、事前に組み立てられた環状オレフィン共重合体(COC)チップの概略図を示しています。コンパートメント化されたチップは、食品着色料の単離によって実証されるように、コンパートメント内に明確な流体微小環境を確立できます(図1C)。

1. hSCニューロン用マルチコンパートメントチップのコーティング

>注:図2Aは、コーティング手順の概要を示しています。

1. ポリ-L-オルニチンを細胞培養グレードの蒸留水に溶解して、20 μg/mLのワーキング溶液のチップあたり600 μLの溶液を調製します。
2. ウェルからチップを調製した後に残った残りのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を吸引します。吸引するときは、ピペットの先端がチャネル開口部から離れていることを確認してください.
   手記：マイクロ流体チャネルは、この手順全体にわたって充填されたままにする必要があります。チャネル/コンパートメントから液体を吸引せず、ウェルからのみ吸引してください。
3. 150 μLのポリ-L-オルニチン作業溶液を右上のウェルにロードします。90秒間、または液体が右下のウェルに充填し始めるまで待ちます。150μLの培地を右下のウェルに加え、液体がマイクログルーブを通過するまで5分間待ちます。
4. 150 μLの培地を左上のウェルに加えます。90秒待ってから、左下のウェルに150μLを加えます。チップのホルダーをパラフィルムで包み、4°Cで一晩置きます
   手記：または、チップとホルダーを37°Cに1時間置きます。
5. ウェルから培地を吸引し、ピペットの先端がチャネル開口部から離れるようにします。150 μLの滅菌水を右上のウェルに加えます。90秒待ってから、右下のウェルに150μLを加えます。液体がマイクログルーブを通過するまで5分間待ちます。
6. 左上のウェルに150μLの滅菌水を加え、90秒待ってから、左下のウェルにさらに150μLを加えます。
7. 手順1.5〜1.6を繰り返します。
8. ラミニンを2°C〜8°Cでゆっくりと解凍し、10 μg/mLの作業溶液を調製します。
9. ラミニン作業溶液150μLを右上のウェルにロードします。90秒間、または液体が右下のウェルに充填し始めるまで待ちます。150μLを右下のウェルにピペットで移します。ラミニンがマイクログルーブを通過するまで5分間待ちます。
10. 150 μLのラミニンを左上のウェルに加えます。90秒待ってから、左下のウェルに150μLを加えます。チップをホルダー内で37°Cで2時間インキュベートします。
11. チップをPBS(Ca²⁺およびMg²⁺なし)ですすいでください。PBS150μLを右上のウェルにロードします。90秒間、または液体が右下のウェルに充填し始めるまで待ちます。150 μLのPBSを右下のウェルに加え、PBSがマイクログルーブを通過するまで5分間待ちます。
12. PBS150μLを左上のウェルにピペットで移します。90秒後、150μLを左下のウェルにピペットで
移します。
13. チップからPBSを吸引し、次にチップをNSCメディアですすいでください(材料の表を参照)。150μLの培地を右上のウェルにロードします。90秒後、または液体が右チャネルを通過して右下のウェルに入ったら、右下のウェルに150μLを加えます。メディアがマイクログルーブを流れるまで5分間待ちます。
14. 150 μLの培地を左上のウェルに加え、さらに150 μLを左下のウェルに加えます。チップを5% CO₂を含む37°Cインキュベーターでインキュベートし、NSCを播種する準備ができるまでチップをプレコンディショニングします
    手記：チップは、必要に応じて一晩中事前にコンディショニングすることができます。

2. マルチコンパートメントチップへの NSC のシード

>注:このプロトコルは、ヒト胚性幹細胞から始まった以前の出版物とは異なり、市販のNSCを使用しました。このプロトコルでは、神経幹細胞はプラスチックチップに直接播種され、そこでニューロンに分化します。細胞は、最大2回の継代でNSCとして(分化せずに)増殖させ、さらに使用するために液体_N2のバイアルに保存することができます。このプロトコルでは、1または2を通過した後、液体N₂に保存されたNSCバイアルを使用します。図2Bは、コーティング手順の概要を示しています。

1. NSCは製造元の指示に従って解凍してください。
   手記：この手順は、H9 から派生した NSC に適用されます。他の細胞株では、細胞密度の最適化が必要です。
2. 血球計算盤を使用して細胞濃度をカウントし、NSC培地を使用して調整して、1mLあたり7 x 10⁶細胞の濃度を取得します。
3. チップの各ウェルから培地を吸引します。メインチャネルからメディアを吸引することは避けてください。
4. 細胞溶液5 μLを右上のウェルにピペットで移し、続いて5 μLを右下のウェルにピペットで移します(合計70,000細胞)。セルがメインチャネルの開口部に向かってピペットで移動していることを確認します。顕微鏡を使用して、細胞がチャネルに入ったことを確認します。細胞がチップの底に付着するまで5分待ちます.
   手記：一方または両方のコンパートメントを使用してセルをロードできます。
5. ~150 μL の NSC 培地を右上のウェルにピペットで移し、次に 150 μL を右下のウェルにピペットで移します。左側で繰り返します。適切な加湿容器内で5%CO₂、37°Cでインキュベートします。
6. 48時間後、ウェルからNSC培地を吸引し、各トップウェルと各ボトムウェルに150μLを添加して神経分化培地と交換します。
7. 適切な加湿容器内の5% CO₂、37°Cインキュベーター内でニューロンを培養します。

結果

図1:組み立て済みのCOC、マルチコンパートメントマイクロ流体チップ(A)上部と下部のウェルを識別するチップの図面。チップのサイズは75mm×25mmで、標準的な顕微鏡スライドのサイズです。(B)チャネルとチャネルを分離するマイクログルーブを示すズームイン領域。(C)この写真は、食品着色料を使用して各コンパートメント内に分離された微小環境を作り出していることを示しています。

図2:プラスチックコンパートメント化された...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
完全神経幹細胞培地:
レックHU EGF 10 UGバイオソース(TM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0314	20ng/mL
REC HU FGF BASIC 10 UGバイオソース(TM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0024	20ng/mL
GlutaMAX サプリメント (100倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061	2mM
ノックアウトDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12660012
StemProニューラルサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1050801	2%
カルシウムとマグネシウムを含まない Gibco DPBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144
ギブコ ヒューマン NSC (H9) キット コンボキット	ギブコ	N7800200
Gibco ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017015
ガラスパスツールピペット	シグマ・アルドリッチ	CLS7095D5Xシグマ	長さ5.75
H9由来HU神経幹細胞 1E6細胞/バイアル;1ミリリットル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	510088
hibernate-Eミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1247601
インキュベーター、5% CO2 37 °C
フロスティ氏	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒5100-0001
神経分化培地			100mLあたり。
抗生物質-抗真菌薬(100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15240112	1mL(100倍)
アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A8960	200mM
BDNFの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHC7074	40 ng/mL
Gibco B27 Plus サプリメント (50X)	フィッシャーサイエンティフィック	A3582801	2mL(50倍)
Gibco CultureOne サプリメント (100X)	フィッシャーサイエンティフィック	A3320201	1mL(100倍)
Gibco ニューロバサル プラス ミディアム	フィッシャーサイエンティフィック	A3582901
StemPro Accutase 細胞解離試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1110501
XCプレコート	Xona Microfluidics, LLC	XCプレコート	XonaChipsに含まれています
Xonaチップ	Xona Microfluidics, LLC	XC450	長さ450μmのマイクログルーブバリア
加湿器トレイ	Xona Microfluidics, LLC	加湿器トレイ