出生後マウス小脳からの幹細胞の単離と神経細胞への分化

1. 溶液の準備

1. 滅菌フェノールレッド含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)とパパイン(100 U / ml)、システイン(0.2 mg / ml)、およびデオキシリボヌクレアーゼ(DNase、250 U / ml)から作製した組織解離溶液を調製します。
2. DNase溶液を調製するには、DNase Iの凍結乾燥粉末100mg(1本)を50mLのH₂Oに希釈し、よく混合し、ストック溶液をろ過します。10mLのストックアリコートを準備します。1本のストックチューブを0.5 mLのシングルユースアリコートに分割します。これらのシングルユースアリコートは-80°Cで保存してください。
3. 磁気カラムバッファーX:0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液を調製することにより、磁気分離試薬を調製します。
4. ニューロスフェア培地を調製するには、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むニューロベース培地とL-グルタミンを使用し、2% B27、20 ng/mL ヒト組換え上皮成長因子(EGF)、および 20 ng/mL ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を補給します。
5. 分化培地を調製するには、神経基礎培地を使用し、10 ng/mL 分化因子血小板由来成長因子(PDGF-AA)または 10 ng/mL 白血病抑制因子(LIF)と 2% B27 を添加します。
6. 超低アタッチメントの12ウェル(3.5 cm²)および6ウェル(9.6 cm²)の培養プレートを使用してください。

2. 小脳の解剖

1. マウスの子犬(P3-P7)をイソフルランで麻酔し、手術用ハサミを使用して斬首します。
2. 子犬の分離した頭に70%エタノールをスプレーします。
3. 各ヘッドを空の滅菌10cm培養皿に移します。マイクロダイセクションハサミを使用して皮膚を分離し、ハサミを正中線に沿って矢状に走らせて頭蓋骨を切除します。
4. #7鉗子を使用して、脳幹から尾側から始まる頭蓋骨をはがします。小脳を無傷に保ちながら、へらを使用して脳を慎重に持ち上げ、15 mLの氷冷ハンクスバランスソルト溶液(HBSS)溶液を含む新鮮な滅菌10.0cm皿に脳を移します。.
5. 脳が入った皿を解剖顕微鏡の下に置きます。細い#5鉗子を使用して、小脳から髄膜と大きな血管を取り除き、へらを使用して小脳を脳幹から分離します。
6. 小脳を5.0mLの氷冷HBSS溶液を含む15mLの遠心分離チューブに移します。小脳を洗浄し、5.0mLのHBSS.
   で3回すすぎ、デカントします。 手記： 各小脳は、さらなる処理のためにそれ自身のチューブに入れるべきです。

3. 細胞懸濁液の調製

1. 脳が入った皿を解剖顕微鏡の下に置きます。細い#5鉗子を使用して、小脳から髄膜と大きな血管を取り除き、へらを使用して小脳を脳幹から分離します。
2. 小脳を5.0mLの氷冷HBSS溶液を含む15mLの遠心分離チューブに移します。小脳を洗浄し、5.0mLのHBSS.
   で3回すすぎ、デカントします。 手記： 各小脳は、さらなる処理のためにそれ自身のチューブに入れるべきです。
3. 最後のすすぎ後、37°Cに予め温めた5 mLのパパインベースの組織解離溶液を加え、組織を水浴中で37°Cで15分間インキュベートします。チューブを3分ごとに3〜5回上下に反転させることにより、中身をゆっくりと混合します。
4. 前述のように、広径(通常のガラス製ピペット)と小径のパスツールピペット(ブンゼンバーナーで加熱して磨く)を準備します。
5. 組織を5mLのHBSS溶液で3回洗浄し、手でデカンテーションしながら組織が失われないようにします。
6. 最後のHBSS洗浄液を取り出し、250μLのDNase溶液を含む5mLのDPBS溶液を組織に加えます。広径パスツールピペットを使用して10倍〜15倍を粉砕することにより、組織を解離します。気泡の形成を避けるために、この手順を穏やかに実行します。
7. 次に、スラリーをウォーターバス中で37°Cでさらに10分間インキュベートし、チューブを反転させて矯正して混合します。
8. 直径を縮小したパスツールピペットを使用して、組織スラリーをさらに10倍に粉砕します。大きな組織片が残っている場合は、ピペットの先端で組織片をチューブの底にそっと押し付け、細胞が細かい懸濁液に達するまでピペッティングを続けます。
9. 組織を37°Cでさらに10分間インキュベートし、前の混合ステップを繰り返します。

4. 幹細胞の免疫標識

1. 遠心分離管を氷の上に置き、次のステップのために氷冷溶液を使用します。解離した細胞を40 μmの細胞ストレーナーで50 mLの遠心チューブに濾します。フィルターに10.0 mLのHBSS溶液をトッピングして、この追加溶液で細胞がメッシュを通過することを確認します。
2. ろ過した細胞を新鮮な15mLの遠心チューブに移し、細胞懸濁液を300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
3. ペレットを160 μLの磁気カラムバッファーに再懸濁します。磁気標識前にシングルセル懸濁液を得るには、細胞を30 μmのナイロンメッシュに通して、カラムを詰まらせる可能性のある細胞塊を取り除きます。
4. 各15 mLチューブに40 μLの抗プロミニン-1マイクロビーズを加えて混合し、冷蔵庫で15分間インキュベートして、抗体がプロミニン-1発現細胞に結合します。
5. 1.0〜2.0 mLのカラムバッファーXを加えて細胞を洗浄し、300 x gで10分間遠心分離します。
6. ペレットを1.0 mLのカラムバッファーX.
   に再懸濁します。 手記：1.0 mLのカラムバッファーXでペレットを再懸濁した後に小さな凝集体が見られる場合は、パスツールピペットの先端を使用して慎重に除去する必要があります。そうしないと、これらの凝集塊が細胞ソーティング中に磁気カラムをブロックする可能性があります。

5. 磁気カラムの調製、細胞選別、めっき

>注:遅延は神経圏の形態に影響を与える可能性があるため、異なる遺伝子型条件(疾患対制御)からの磁気分離を同時に実行する必要があります。

1. 磁気カラムは、磁場にさらされた磁気スタンドに置いて準備します。500 μL のバッファー X でカラムを 1 回すすぎ、廃棄する遠心チューブに滴下するバッファーを塗布します。
   手記： 各実験に新しい磁気カラムバッファーXを調製します。そうでない場合、幹細胞の収量は低くなります。
2. 標識した細胞懸濁液をカラムに塗布します。主に小脳ニューロン/グリア混合細胞からなる非標識細胞を含むフロースルーを新鮮な15 mLチューブに集めます(図1A)。
3. カラムを 500 μL のバッファー X で 3 回洗浄します (各洗浄には約 2 〜 4 分かかります).
   手記： 小脳顆粒ニューロンが豊富な小脳ニューロン/グリア混合培養は、この精製ステップの有用な副産物として役立つことができます。
4. カラムを磁場から取り出し、1.5 mLチューブに入れます。1.0 mLの培地(ニューロスフィア培地)をカラムに加え、プランジャーをカラムに押し込んで、prominin-1ビーズでタグ付けされた細胞を新鮮な1.5 mLのファルコンチューブに洗い流します。
5. プロミニン-1標識細胞の純度を高めるには、ステップ5.1〜5.4に従って、溶出した細胞を2番目のカラムに通します。
6. 血球計算盤で細胞を数えます。典型的な収量は、小脳あたり10⁷細胞です。細胞を超低接着プレート(下流の実験に必要な密度に基づく6ウェルまたは12ウェル)にプレートします。

>6. ニューロスフェアの継代と分化

1. prominin-1標識幹細胞を超低接着性の12ウェルプレートにニューロスフェア培地(5,000細胞/ウェル)でプレート化します。
2. 7〜10日後、細胞は分裂してボール状の浮遊ニューロスフェア(一次ニューロスフェア)を生成します
   手記：この実験では、さらに使用するために、数が増える二次的なニューロスフェアが生成されます。初代ニューロスフェア集団は、幹細胞の特性を持たない汚染細胞を含んでいる可能性があり、ニューロスフェアと凝集する可能性があるため、これらの実験には使用されません。
3. 継代では、1.0 mLピペットチップを使用して、1.0 mLピペットチップを使用して、一次ニューロスフェアと培養培地を15 mLの滅菌遠心チューブに移します。ニューロスフェアを300 x gで5分間遠心分離してペレット化し、上清を捨てます。
4. ペレットを、パパインまたは0.05%トリプシン溶液を含む5 mLの組織解離培地に再懸濁します。.37°Cで10分間インキュベートします。
5. 細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離し、細胞を5 mLのニューロスフェア培地に再懸濁し、プラスチック製のパスツールピペットを使用して細胞を機械的に解離し、ゆっくりと10倍上下にピペッティングします。
6. 前述のように、細胞を(再度)ニューロスフェア培地に播種します。培養で7〜10日後、プレートは二次神経球で濃縮されるべきです.
   手記：これらの培養物は、効率よく8倍まで継代することができ、その後、ニューロスフェアのサイズは小さくなる傾向があり、増殖の減少を示唆しています。
7. 血球計算盤で細胞をカウントし、ポリ-D-リジンコーティングプレート(6ウェルまたは12ウェル)での将来の実験に最適な数をプレート化します。
8. 幹細胞を分化するためには、ペレットに分化培地を添加する以外は、前述のように遠心分離により2番目から8番目の継代からニューロスフェアを採取します
   手記：in vitroで7日後、幹細胞はニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化します。これは、ニューロンマーカーのβ-IIIチューブリン、アストロサイトマーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびオリゴデンドロサイトマーカーO4による染色によって示されています。

図1:出生後の小脳からのプロミニン-1幹細胞の単離。 (A)小脳幹細胞は、免疫磁性プロミニン-1ビーズを用いて単離した。トップパネル:精製された幹細胞(カラム結合)は、広範な増殖と自己再生特性を持つニューロスフェアを形成しました。カラムに結合していない細胞(フロースルー)は、ニューロスフェアを形成することができませんでした。代わりに、彼らは小脳ニューロン/グリア混合細胞(β-IIIチューブリン/ GFAP)になりました。下面パネル:幹細胞特異的マーカー(Nestin、prominin-1、GFAP)を発現するprominin-1+細胞から形成されたニューロスフェア。(B)フロースルー中の細胞は、幹細胞マーカーprominin-1およびnestinに対して陰性に染色され、ニューロンマーカー β-IIIチューブリンに対して陽性であった。