網膜神経節ニューロンと嗅覚被覆グリアの共培養

要約

出典:Portela-Lomba, M., et al.成人の軸索再生のインビトロモデルとしての、嗅覚被覆グリアを持つ軸索化ラット網膜神経節ニューロンの共培養。J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオは、ラットの網膜から網膜神経節ニューロン(RGN)を分離し、それらを嗅覚被覆グリア(OEG)細胞と共培養する手順を示しています。この方法により、神経損傷後のOEGの神経再生能力を研究することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. アッセイのためのihOEG(Ts12およびTs14)の調製

>注:この手順は、RGNの解剖と共培養の24時間前に実行する必要があります。

1. 12 mm Ø カバーガラスを 10 μg/mL ポリ-L-リジン (PLL) で 1 時間
   で処理します。 手記：カバースリップはPLL溶液に一晩置いておくことができます。
2. カバーガラスを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。
3. Ts12およびTs14 ihOEG細胞をp60細胞培養皿から分離します。
   1. 15 mLのコニカルチューブに4 mLのDMEM/F12(基礎培地)-FBS(ウシ胎児血清)培地を加えます。きれいな水浴で37°Cで温めます。
   2. プレートから培地を取り出し、1 mLの1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)で細胞を1回洗浄します。
   3. 1 mLのトリプシン-EDTAをOEG細胞に添加し、37°C、5%CO₂で3〜5分間インキュベートします。
   4. p1000ピペットで細胞を採取し、ステップ2.1で調製した培地に移します。
   5. 200 x gで5分間遠心分離します。
   6. 上澄みを熱望します。
   7. ME10培地1mLを加え、ペレットを再懸濁します。
   8. 血球計算盤で細胞数を数えます。
4. 80,000 Ts14 細胞または 100,000 Ts12 細胞/ウェルを 500 μL の ME10 培地中の 24 ウェルプレートのカバースリップに播種します。
5. 細胞を37°Cで5%_CO2で24時間培養します。

2. 網膜組織解剖

>注:生後2ヶ月の雄のWistarラットがRGNソースとして使用されます。24ウェルセルディッシュの20ウェル用の2つの網膜(1匹のラット)。使用前にオートクレーブ手術用材料。パパイン解離キットは市販されています(材料の表)。プロバイダーの指示に従って再構成します。D、L-2-アミノ-5-ホスホ吉草酸(APV)を5 mMストックに再構成し、アリコートを調製します。

1. アッセイ当日は、以下の培地を調製してください。
   1. 5 mLの冷たいEBSS(Earle's balanced salt solution)(パパイン解離キットのバイアル1)を含むp60細胞培養皿を調製します。
   2. パパイン解離キットの再構成バイアル2(パパイン)と50μLのAPVでp60細胞培養皿を調製します。次に、再構成したバイアル3 250 μL (DNase と 5 μL の APV) を加えます。
   3. 滅菌チューブ内で、2.7 mLのバイアル1と300 μLのバイアル4(アルブミン-オボムコイドプロテアーゼ阻害剤)を混合します。150 μL のバイアル 3 (DNase) と 30 μL の APV を加えます。
   4. 20 mLのNeurobasal-B27培地(NB-B27)を調製します。.
2. ネズミをCO₂で窒息死させます。
3. ギロチンで頭を斬首し、100 mmのシャーレに入れ、頭にエタノール70%をスプレーしてから、層流フードに入れます。
4. ネズミのひげをハサミで切って、目の操作を妨げないようにします。
5. 鉗子で視神経をつかみ、メスで目を切開できるほど眼球を引き抜きます。
6. 水晶体と硝子体液を取り除き、網膜(オレンジ色のような組織)を引き出し、残りの眼の層(色素上皮層を含む)は内側にとどまります。
7. ステップ2.1.1で調製したp60細胞培養皿に網膜を入れます。
8. ステップ2.1.2で調製したp60細胞培養皿に網膜を移し、メスで約1mm<小片に切断します。
9. 15mLのプラスチックチューブに移します。
10. 組織を37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂未満で30分間インキュベートし、10分ごとに攪拌します。
11. ガラス製のパスツールピペットでピペッティングを上下させて、細胞の凝集体を解離します。
12. 細胞懸濁液を200 x gで5分間遠心分離します。
13. 上清を捨てます。パパインを不活性化するには、ステップ2.1.3で調製した溶液(2眼に対して1.5 mL)に細胞ペレットを再懸 ?? します。.
14. この細胞懸濁液を5 mLの再溶解バイアル4に慎重にピペットで移します。
15. 200 x gで5分間遠心分離します。
16. 遠心分離中に、ME-10培地をOEG 24ウェルセルプレート(ステップ1で調製済み)から完全に取り出し、ウェルあたり500 μLのNB-B27培地と交換します。
17. 上清を捨て、細胞を2 mLのNB-B27培地に再懸濁します。
18. m24プレートのウェルごとに100μLの網膜細胞懸濁液をPLL処理またはOEG単層カバースリップにプレートします。
19. NB-B27培地で5%_CO2を含む37°Cで96時間培養します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B-27 サプリメント	ギブコ	17504044
D,L-2-アミノ-5-ホスホ吉草酸	シグマ	283967	NMDA受容体阻害剤
DMEM-F12	ギブコ	11320033	細胞培養培地
FBSの	ギブコ	11573397	ウシ胎児血清
FBS-ハイクロン	フィッシャーサイエンティフィック	16291082	ウシ胎児血清
L-グルタミン	ロンザ	BE17-605F
ニューロベースルミディアム	ギブコ	21103049	神経細胞培養液
パパイン解離システム	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LK003150	神経細胞の単離に使用
PBSの	自家製
PBS-エドタ	ロンザ	H3BE02-017Fシリーズ
ペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシンB	ロンザ	17-745E	静菌性および殺菌性
下垂体抽出物	ギブコ	13028014	ウシ下垂体抽出物
ポリ-L-リジン(PLL)	シグマ	A-003-M