ラット頭部筋組織からサテライト細胞を単離する技術

要約

出典:Carvajal Monroy, P. L., et al.ラット頭部分枝量筋からの衛星細胞の単離と特性評価。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、組織解剖、酵素消化、その後の機械的精製および遠心精製を通じて、ラット頭部分枝量筋組織からの衛星細胞の単離を示しています。次に、細胞は細胞外マトリックスでコーティングされたウェルに播種され、筋芽細胞に分化し、最終的には筋管と成熟筋繊維に分化します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 細胞外マトリックスゲルスポット

1. 隔離の 1 日前に、次の手順を実行します。
   1. 細胞外マトリックスゲル(100 μL)のアリコートを4°Cで少なくとも1.5時間解凍し、4,500 mg/Lグルコース、4 mM L-グルタミン、および110 mg/mlピルビン酸ナトリウム(DMEM)で1:10を希釈します。細胞外マトリックスゲルは常に4°Cに保ちます.
      注意: 急激な温度変化は、コーティングと結晶形成の不均一化につながります。
   2. 希釈した細胞外マトリックスゲル溶液を氷上に15分間保存します。
   3. 20 μLのマイクロピペットを10分間予冷します。
   4. 8ウェルチャンバースライドを100 mmのペトリ皿に入れ、皿を冷たい表面(フリーザーパックなど)に10分間移します。
   5. あらかじめ冷やしておいたマイクロピペットを使用して、各ウェルに10 μlの細胞外マトリックスゲルを一滴入れます。ペトリ皿を冷たい面に少なくともさらに7分間置いておきます(図1A)。
   6. 残った細胞外マトリックスゲル(図1B)を完全に除去し、ウェルを37°Cで一晩乾燥させます。

>2. 頭部筋の解剖(咬筋、二胃筋、および挙筋ヴェリ・パラティーニ)

1. 解剖する前に、2%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を補給した50mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を準備します。氷の上を保ってください。
2. 1匹の若年成体ラット(9週間)をCO₂ / O₂で安楽死させた後、頭を斬首し、頭から皮膚を取り除きます。ヘッドを氷冷PBSに移し、50mlチューブに2%P / Sを添加します。
3. 咬筋(第1分枝弓に由来)
   1. 頭の片側を上にしてシリコンパッドに置き、皮下注射針で固定します(図2A)。
   2. 耳下腺と顔面神経を特定します(図2A)。腺を覆う深い筋膜を露出させます。筋膜を切断し、解剖ハサミを使用して腺を取り除きます。外耳道を特定します。茎状突孔から顔面神経をなぞり、メス刃15号で側頭枝、頬骨枝、頬側枝を丁寧に切除します。
   3. 筋膜を取り除くことにより、咬筋の表在する頭を解放します。咬筋の表在性頭部と深部頭部の両方を特定します。その厚い腱性腱膜が上顎骨の頬骨突起に挿入されるまで、表在性の頭をなぞります。
   4. 頬骨突起で腱をその起源からまっすぐな鉗子で分離します。メス刃15番または解剖ハサミで切り、慎重に持ち上げます(図2B)。
   5. 咬筋の表面頭部を、メスの刃No.15(図2C)を使用して、下顎骨の枝の外側表面の角度と下半分に挿入されるまで解剖します。次に、筋肉を完全に取り除きます。
4. 二腹筋の後腹(第2分枝弓に由来)
   1. 頭をシリコンパッドの仰臥位に置き、皮下注射針で固定します(図3A)。
   2. 舌下腺と顎下腺の両方を覆っている皮下脂肪を取り除きます。次に、解剖ハサミを使用して表在性筋膜と腺を取り除きます。二腹部筋(前腹と後腹)を露出させます。
   3. 後腹の前腱をまっすぐな鉗子で保持し、切開し、その起源が鼓膜にあるまで慎重に解剖します(図3B)。反対側でも同じことを行います。
5. 口蓋挙筋(第4分枝弓に由来)
   1. 二腹部筋の後腹部を解剖した後、茎状舌骨筋の位置を特定し、横方向に引っ張って慎重に取り除きます(図4A)。
   2. 鼓膜の水疱に挿入される口蓋挙筋の腱の位置を特定します(図4A)。丁寧に解剖し、両面に切ります。
   3. 気管とその後ろを走る食道を探します。食道を持ち上げ、咽頭と喉頭を露出させます。
   4. 上咽頭収縮筋の領域を位置特定して解剖します。口蓋挙筋を特定し、両側でカットします(図4B).
      手記：解剖直後、実体顕微鏡下で各筋肉から腱と結合組織を慎重に取り除きます。すべての検体を70%エタノールにすばやく浸し、15 mLチューブに2% P/Sを添加した氷冷PBSに移します。

3. サテライトセル(SC)の分離

1. 3つの筋肉群からのSC分離のために、次の準備手順を実行します。
   1. DMEM中に7.5mlの0.1%プロナーゼを調製します。0.22 μmフィルターで溶液をろ過します。溶液を37°Cの水浴中で10分間予温してから、分離します。
   2. 10%馬血清(HS)と1%P / Sを補給した35mlのDMEMを準備します。また、水浴中で37°Cで予温します。
   3. 20% ウシ胎児血清 (FBS)、10% HS、1% P/S、および 1% ニワトリ胚抽出物 (CEE) を添加した DMEM からなる 15 ml の培地を準備します。水浴中で37°Cで予温します。
   4. 6本のプラスチックピペット(10 ml)をHSで事前にコーティングし、使用前に少なくとも10分間乾燥させます。
2. 培養フードで、各筋肉を6ウェルプレートのウェルに移します。解剖ハサミを使って、筋肉を約2mmの小片に切ります。ティッシュをミンチにしすぎないように注意してください。
3. 各ウェルに2.5 mLの0.1%プロナーゼ溶液を慎重に加え、37°Cで60分間インキュベートします。20分、40分、60分後にプレートを静かに振< /> 手記：孵化の正確な期間は、動物の年齢や系統などの要因によって異なります。
4. 顕微鏡で監視します。筋肉の断片をチェックし、繊維束が緩んでいるように見える場合は酵素消化を停止します(図5)。
5. 10% HSおよび1% P/Sを添加した2.5 mLのDMEMを15 mLのチューブに移し、チューブを400 x gで5分間遠心分離します。
6. 10% HSと1% P/Sを添加した5 mLのDMEMを添加し、10 mLのプラスチックピペットで溶液を上下にピペットで20回以上ピペットで動かし(トリチュレーション)、組織を均質化します。
7. チューブを200 x gで4分間遠心分離し、上清を回収して15 mLのチューブに移します。
8. 10% HSと1% P/Sを添加した5 mLのDMEMを添加し、再度10 mLのプラスチックピペットで組織片が通過するまでピペットで動かします。
9. チューブを200 x gで4分間遠心分離し、上清を15 mLのチューブに回収します。
10. 50 mLのチューブにセルストレーナー(40 μm)をセットし、解離した細胞を含む上清をフィルターに移します。細胞の回収率を最大限に高めるために、1 mLのDMEMで洗浄します。
11. チューブを1,000 x gで10分間遠心分離し、上清をピペットで捨てます。
12. ペレットを300 μlの培地に再懸濁し、血球計算盤で細胞をカウントします。

>4. 細胞外マトリックスゲルスポット上のサテライト細胞の分化

1. 細胞懸濁液を希釈して、10 μlの培地に1.5 x 10³細胞を得ます。
2. チャンバースライドのカバーをテープで固定し、オブジェクトガラスの底面に黒いマーカーでスポットに印を付けます。
3. マイクロピペットを使用して、10 μlの細胞懸濁液を細胞外マトリックスゲルスポットに滴下します。顕微鏡下で、細胞懸濁液の滴がその場に正しく配置されているかどうかを確認します。37°Cで6時間インキュベートします。
4. 400 μlの培地(DMEMに20% FBS、10% HS、1% P/S、および1% CEEを添加)を慎重に加え、37 °Cで3日間インキュベートします
   手記：この時点で、新たに分離されたSCは大規模なトラウマ(酵素消化と厳しいトリチュレーション)を受け、回復する必要があります。最初の3日間は細胞を乱さないでください。次に、実験の種類によって培地を変えることができます
   細胞外マトリックスゲルスポットには、分化アッセイのために高細胞密度(1.5-2.5 x 10³/20 μl)を播種することができます。培地(20% FBS、10% HS、1% P/S、1% ニワトリ胚抽出物を添加したDMEM)は、3日おきに交換できます。

結果

図1:チャンバースライド内の細胞外マトリックスゲルスポット。(A)操作を容易にするために、8ウェルチャンバースライドを100mmのペトリ皿に入れます。各チャンバーで10 μlの細胞外マトリックスゲルをピペットで取り、冷たい表面に置きます (7 分間)。(B)余分な細胞外マトリックスゲルを除去した後のチャンバースライド。

図2:咬筋の解剖。(A)側面図での動物の頭部。耳(E)、耳下腺(P)、顔面神経(...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
皮下注射針 25 G 0.5 x 25メートル	BDマイクロランス	300400
解剖ハサミ	ブラウン	BC154Rの
マイクロ鉗子ストレート	ブラウン	BD330Rの
外科用メスブレード No.15	スワン・モートン	0205
アルコール度数70%	デンテック	2,010,005
パーマノックススライド、8チャンバー	サーモサイエンティフィック	177445
6ウェル細胞培養プレート	グライナーバイオワン	657160
細胞培養ディッシュ (100 x 20 mm)	グライナーバイオワン	664160
15 mL滅菌円錐形遠心分離チューブ	BDバイオサイエンス	352097
50 mL滅菌円錐形遠心分離管	BDバイオサイエンス	352098
セルストレーナー(40μm)	ギブコ	431750
10ml血清ピペット	グライナーバイオワン	607180
20μlのFT20	グライナーバイオワン	774288
マトリゲル、フェノールレッドフリー	BDバイオサイエンス	356237	10ミリリットル
プロナーゼ	カルバイオケム	53702	10 KU
リン酸緩衝生理食塩水	ギブコ	14190-144	500ミリリットル
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム、高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸	ギブコ	〒10569-010	500ミリリットル
ウシ胎児血清	フィッシャーサイエンティフィック	3600511	500ミリリットル
ホースセラム	ギブコ	26050088	500ミリリットル
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	ギブコ	15140-122	100ミリリットル
鶏胚エキス	MPバイオメディカル	2850145	20ミリリットル

千株