マウス胚性癌細胞を用いたレチノイン酸誘導性新生

要約

出典: Leszczyński, P., et al., Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、P19マウス胚性癌細胞におけるレチノイン酸誘導性神経新生の簡単な技術を示しています。レチノイン酸は転写因子を活性化し、ニューロンの分化のための遺伝子発現を誘発します。

プロトコル

1. 集計生成

1. 10 mLのDifferentiation Mediumに5 μLのRA(レチノイン酸)(99.8%エタノールに溶解した1 mMストック、-20°Cで保存)を加え、よく混合します(最終濃度0.5 μM RA)
   手記：RAは光に敏感です。低濃度のエタノールは細胞分化に影響を与えません。
2. 10 mLの分化培地(RA入り)を100 mmの未処理培養皿(懸濁培養専用)に加えます。
3. 100 mmディッシュ(ディッシュ表面積56.5 cm2)に1 x 10⁶セルを播種します。
4. 細胞を入れたフラスコを37°C、5%CO₂のインキュベーターに2日間入れて、凝集体の形成を促進します。
5. 2日後、Differentiation Mediumを交換してください。凝集体を含む培地を10 mLピペットで吸引し、RTで15 mLチューブに移します。
6. 凝集体を重力によってRTで1.5分間沈降させます。
7. 上清を捨てます。
8. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、0.5 μM RAを含む新鮮な10 mLの分化培地を加えます
   注意：細胞凝集体を上下にピペットで動かさないでください。
9. 骨材を新しい100 mmの未処理培養皿(懸濁培養専用)に播種します。
10. プレートをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に2日間置きます。

2. アグリゲートの解離

1. 10 mLピペットを使用して細胞凝集体を吸引します。
2. 凝集体を15mLチューブに移します。セル凝集体が重力によって1.5分間沈殿するのを待ちます。
3. 上清を取り除きます。
4. 凝集体はDMEMのみで洗浄します(血清および抗生物質を含まない)。
5. セル凝集体をRTで1.5分間重力沈降により沈降させます。
6. 上清を吸引し、2 mLのトリプシン-EDTA(0.25%)を追加します。.
7. 細胞凝集体を水浴(37°C)に10分間入れ、手で軽くたたいて2分ごとに凝集体を穏やかに攪拌します。
8. 4 mLのメンテナンス培地を追加して、トリプシン化プロセスを停止します。.
9. 1mLピペットを使用して、骨材を20回上下にピペットで動かします。
10. 細胞を200 x gおよびRTで5分間遠心分離します。
11. 上清を取り除き、細胞ペレットを5 mLのメンテナンス培地に再懸濁します。
12. セルカウンタでセル番号を確認します。

>3. めっきセル

1. メンテナンス培地のウェルあたり3 mLを6ウェルプレートに加えます。
2. 6ウェル培養プレート中の細胞を0.5 x 10⁶/ウェルの密度で播種します。
3. 37°Cで5%_CO2濃度でインキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM高グルコース(4.5 g / L)とL-グルタミン	ロンザ	BE12-604Q
エタノール 99.8%	ケムプール	ケム*613964202
ウシ胎児血清(FBS)	ユーロ	E5050-03
ペニシリン/ストレプトマイシン 10K/10K	ロンザ	DE17-602E
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まない1倍濃縮	ロンザ	BE17-517Q
レチノイン酸	シグマ-アルドリッチ	R2625-50MG	99.8% エタノールに溶解し、-20 °C で最大 6 ヵ月間保存
トリプシン0.25% - HBSSのEDTA、カルシウムおよびマグネシウムイオンなし、フェノールレッド	バイオセラ	LM-T1720/500
1 mLセロロジカルピペット	プロフィラボ	515.01
10 mLセロロジカルピペット	プロフィラボ	515.1
懸濁培養専用の100mmディッシュ	コーニング	C351029
15 mL遠心チューブ	シグマ-アルドリッチ	CLS430791-500EA
5 mL 血清ピペット	プロフィラボ	515円05銭
6ウェルプレート	コーニング	CLS3516
細胞培養フラスコ、表面積25cm四方	シグマ-アルドリッチ	CLS430639-200EA

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