レチノイン酸を用いた胚様体細胞の神経前駆細胞への分化

要約

出典:Yang, J., et al. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (2017年)。

レチノイン酸を用いて幹細胞を神経前駆細胞に分化誘導する方法と、吊り下げ培養法を実演しています。

プロトコル

1. マウス胚性線維芽細胞(MEFs)の培養

1. MEF培地、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、高グルコース)を調製し、15%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。
2. 100 mm細胞培養皿に0.5%ゼラチン溶液を室温(RT)で30分間コーティングします。
3. サイトメーターを使用してMEFをカウントします。ゼラチン溶液を取り出し、すぐに37°Cに予熱したMEF培地を注ぎます。マイトマイシンC処理されたMEFのバイアルを37°Cの水浴で2分間急速に解凍し、100mmゼラチンコーティング皿あたり2.8 x 10⁶ MEFを播種します。他のサイズの皿を使用する場合は、それに応じてセル番号を調整します。MEFを37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。
4. 翌日に媒体を交換してください。MEF層がコンフルエントになるまで2〜3日間培養します。

2. マウス胚性幹細胞またはESC培養

1. 15% FBS と 10 個の³ U/mL 白血病抑制因子 (LIF)、0.1 mM 非必須アミノ酸、55 mM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン (100 U/mL)、ストレプトマイシン (100 μg/mL)、ゲンタマイシン (200 μg/mL)、および 0.2% マイコプラズマ抗生物質を添加した Iscove の改変ダルベッコ培地 (IMDM) である ESC 培地を調製します。
2. ステップ1で準備した皿からMEF培地を取り出し、37°Cの予熱済みESC培地と交換します。
3. ESCバイアルを解凍し、MEF層の上に細胞を播種します。ESCがコンフルエントに達するまで、37°C、5%CO₂でインキュベートします。
4. MEFのコンフルエント単層を含む新しい細胞培養皿を調製します。ESCを継代するには、PBSで一度洗浄し、0.25%トリプシン/ EDTAで37°C、5%CO₂で2〜5分間取り外します。剥離細胞に15% FBSを含む新鮮なIMDMを添加してトリプシン化を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、160 x gでRTで5分間遠心分離します。
5. 上清を除去し、ESCを新鮮なIMDMで再懸濁し、細胞の5分の1を新しいMEFコーティング皿ごとに継代し、細胞がコンフルエントに達するまで(通常4-5日)インキュベートする。

>3. ゼラチンコーティングプレート上のMEFと培養ESCの撤回

1. ECSがコンフルエントに達したら、ステップ2.4と同様に、ECSとMEFを0.25%トリプシン/EDTAで分離し、細胞を新鮮なIMDMに再懸濁し、非接着性の細菌学的シャーレに移し、37°C、5%CO₂で40分間インキュベートします。
2. ESCおよびMEF含有培地を5 mLピペットを使用して新しいゼラチンコーティングプレートに慎重に移し、ピペッティングを繰り返さないようにします。ESCは付着しないため、ペトリ皿に残っている細胞はMEFです。
3. ESCを3〜4日ごとに通過させます。継代の頻度が少ないと、ESCの多能性が低下する可能性があります。.60% の合流点を超えないようにしてください。これは、差別化に有利になる可能性があるためです。
4. 必要に応じて、20倍対物レンズを使用して細胞培養顕微鏡でMEFが検出されなくなるまで、手順3.2〜3.3を3回以上繰り返して、MEFが存在しないことを確認します。
5. ESCの多能性を確認するために、ESC培養物をチェックして、細胞が典型的なESC多角形形態で密集したコロニーを形成するかどうかを確認します(図1A)。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、免疫ブロッティング、またはコア多能性転写因子の免疫蛍光法による細胞幹細胞の試験(図2)。

4. EBフォーメーション

1. DMSOで10 mMのall-trans-RAストック溶液を調製し、1.5 mLの光保護マイクロチューブに分注します。溶液は-80°Cで最大2週間安定です。光から守ってください。
2. ステップ 2.4 と同様に ESC をトリプシン処理し、LIF を使用せずに新しい IMDM をシングルセル懸濁液として再播種します。
3. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、0.5 μM RAを含むIMDM中の5 x 10⁵細胞/mL懸濁液を調製します。
4. 100mmシャーレ100mmあたり20μL滴を8チャンネルピペットと200μLチップで100滴プレートし、ディッシュを反転させ、逆さまのフタにPBSを充填して、吊り下げた液滴が乾燥しないようにします。RA含有培地を光から保護します。
5. EBを37°C、5%CO₂の吊り下げ液滴中で4日間培養します。

結果

図 1: 3D培養におけるSyx^+/+およびSyx^-/-EBSからの芽の出現。(A)Syx^+/+およびSyx^-/-ESCは、神経分化の誘導前にクラスター化されたコロニーで成長しました。(BおよびC)0.5μM RAで吊り下げ液滴で形成されたEBの画像、およびRAのない3Dコラーゲンマトリックスに挿入された画像。画像は、示された対物レンズ (スケール バー = A と C で 100 μm、B で 200 μm) によって 6 日目に撮影されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
料
MEFs	EMDミリポア	PMEF-CF	ESCフィーダーレイヤー
Esc キー	EMDミリポア	CMTI-2
細胞培養ディッシュ(60mm)	エッペンドルフ	30701119	細胞培養
細胞培養ディッシュ(100mm)	隼	353003	細胞培養
ペトリ皿(100mm)	コーニング	351029	吊り下げドロップ
ダーク1.5ml遠心チューブ	セルトリート・サイエンティフィック・プロダクツ	229437	RAストックソリューション
顕微鏡カバーガラス	フィッシャーブランド	12-545-80	円形、直径12 mm
Superfrost-plus顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	12-550-15
試薬
DMEM	ロンザ	12-709階	MEFの文化
IMDM	ギブコ	12440-046	ESCの文化
ウシ胎児血清(FBS)	EMDミリポア	ES-009-B	ESCの文化
ゼラチン	シグマ・アルドリッチ	G2625	ディッシュコーティング
LIF	R&Dシステム	8878-LF-025	ESCの多能性を維持するために
MEM非必須アミノ酸溶液	ギブコ	11140050	細胞培養
2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023	細胞培養
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122	細胞培養
ゲンタマイシン	ギブコ	15750060	細胞培養
MycoZap Plus-広報	ロンザ	VZA-2022	細胞培養
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25200-072	細胞培養
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
オールトランスレチノイン酸	シグマ・アルドリッチ	R2625-50MG	神経分化の誘導
PBSの	ギブコ	10010049
楽器
広視野顕微鏡	ニコン	エクリプス TS100	細胞培養イメージング