オリゴデンドロサイト前駆細胞のin vitro形質導入誘導性髄鞘形成アッセイ

要約

出典:Peckham, H. M., et al.in vitro髄鞘形成アッセイのための初代オリゴデンドロサイト前駆細胞を選択的に形質導入するためのレンチウイルスの産生と使用。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)をオリゴデンドロサイトに分化させ、後根神経節(DRG)ニューロンとの共培養で髄鞘形成を誘導するためのプロトコルを示しています。OPCは、髄鞘形成を調節するシグナル伝達タンパク質をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されます。形質導入されたOPCをDRGニューロンと共培養して、オリゴデンドロサイトへの分化とシグナル伝達タンパク質による髄鞘形成を評価します。

プロトコル

1. 2K7 レンチベクターのクローニング

1. 目的の遺伝子を2K7レンチウイルスベクターにクローニングする前に、標準的な分子技術を用いて、遺伝子をpENTRベクター(3637 bp、カナマイシン耐性)にサブクローニングします。サブクローニングには、EcoRIおよびSacII制限部位を使用してください。
2. 2K7レンチベクターの増幅
   1. 100 ngのプラスミドDNAをコンピテントセルと穏やかに混合して2K7レンチベクターDNAを形質転換し、氷上で30分間インキュベー
   トします。
   2. 熱ショックDNA/コンピテントセルを42°Cで90秒間混合し、アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(15μg/ml)の両方を含むLB寒天プレート上に37°Cで16〜18時間プレーティングします
      注:クロラムフェニコールは、長い末端リピート間の組換えを防ぐために使用されます。
   3. 翌日、アンピシリン(100 μg/ml)とクロラムフェニコール(15 μg/ml)の両方を含むLuria-Bertani(LB)培地で、選択した細菌クローンを37°Cで16-18時間増殖させます。
3. pENTRベクターから2K7 Lentiベクターへのサブクローニング(図1)。
   1. L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (プロモーター) (60 bng)1-2.5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (目的遺伝子付き) (80 bng)1-2.5 μl K7 レンチベクター (80 ng/μl)1 μl TE-buffer, pH 82-5 μl.合計 8 μl.
   2. -80°Cからクローナーゼ酵素ミックスを取り出し、氷上で2分間解凍します。この酵素が-80°Cからの新鮮なアリコートであることを確認してください。この酵素は、凍結融解サイクルを繰り返すとクローニング効率が大幅に低下
   します
   3. 1反応につき2 μlの酵素を加え、ボルテックスでよく混合し、クロナーゼ反応混合物を23-25°Cで6-24時間インキュベー
   トします。
   4. プロテイナーゼK溶液(酵素キットに付属)1 μlをクローナーゼ反応混合物に加え、37°Cで10分間インキュベートします。
   5. クローナーゼ反応混合物をコンピテントセルに変換し、アンピシリン(100μg/ml)を含むLB培地で選択したコロニーを37°Cで16〜18時間増殖させます。
   6. 市販のプラスミドDNA Miniprepキットを使用して、製造元の指示に従ってDNAを抽出し、精製します。
   7. 制限酵素Spe IおよびSac IIを使用し、製造元の指示に従って適切な緩衝液を使用して、目的のプロモーターと遺伝子を含むフラグメントを除去してDNAを確認します。<br /> 注:このステップは、サブクローニングされたDNAが正しいベクターバックボーンを持つ目的の正しい挿入遺伝子を持っているかどうかを確認するために重要です。フラグメントが挿入されていないベクター自体のサイズは 6.7 kb です。放出された挿入断片のサイズには、プロモーターと目的の挿入遺伝子の両方が含まれます。特定の遺伝子の消化物から予想されるフラグメントサイズを、APE-A Plasmid EditorなどのDNA配列編集プログラムで計算します。
   8. DNAベクターバックボーンと放出されたフラグメントの両方のサイズを確認するには、1%アガロースゲルを1x TAEバッファー(表1を参照)に100 Vで泳動します。
   9. アンピシリン(100μg/ml)を含む500mlのLB培地で37°Cで16〜18時間細菌を増殖させることにより、確認されたDNAを増幅します。
   10. 市販のプラスミドDNA Maxiprepキットを使用して、製造元の指示に従ってDNAを抽出し、精製します。
       手記：Maxiprepは通常、ウイルス産生に必要な十分な量のDNAを生成します。
4. 手順1.3.9-1.3.10を繰り返して、レンチウイルス調製物の次のDNAを増幅します:エンベロープベクター(PMD2.G、6.1 kb)、パッケージベクター(pBR8.91、12.5 kb)、およびコントロールとしての空のレンチウイルスベクター(GFP-CMV-2K7、8.7 kb)です。

2. 2K7ウイルスの生成

>注:1日目:

1. トランスフェクション当日は、25 mLのヒト胚性腎臓(HEK)293 T細胞培地を含むT175フラスコに3,200万個のHEK293 T細胞をプレートします(表1を参照)。あるいは、トランスフェクション当日に時間が限られる場合は、トランスフェクションの前日に1,600万個の細胞をプレート化します
   手記：トランスフェクションは、トランスフェクションの日または当日の前に細胞をプレーティングすることでも同様に成功します。この2つの選択肢のいずれかを使用する場合、ここでの重要なポイントは、トランスフェクションの前に細胞が培養皿の表面に付着していることを確認することです
   手記：2日目:
2. トランスフェクション
   1. トランスフェクションの前に、脱イオン水中に10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA pH 8を含むTris-エチレンジアミン四酢酸(TE)バッファーでDNAを1 μg/μlに希釈します。
   2. 50 mLのチューブに、T175フラスコでトランスフェクションするためのマスターミックス(表2)を調製します。予熱したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)にDNAを添加し、ボルテックスでよく混合した後、滅菌ポリエチレンイミン(PEI)を添加します(早期の沈殿を避けるために表1を参照)。
   3. チューブを3〜4倍反転させてよく混合し、室温(RT)で15分間インキュベー
   トします。
   4. HEK293Tセルでメディアの全交換を実行します。細胞から培地を完全に吸引し、予め加温したHEK293T細胞培養培地(T175フラスコあたり25 mL)を給餌します。
   5. トランスフェクション混合物(DNA/PEI混合物)を単層細胞に滴下します。穏やかに動かしてよく混合し、トランスフェクションした細胞を37°C、5%CO2で一晩インキュベートします
      注:3日目:
   6. トランスフェクションが成功したことを確認するには、トランスフェクションの24時間後に蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を確認します
      手記：GFPを発現する細胞の50%以上は、通常、良好なトランスフェクションを示しています.
      手記：4日目:
3. トランスフェクション後48時間で、ウイルス上清を回収し、新鮮なHEK293 T培地(T175フラスコあたり25 mL)と交換します。
   1. ウイルス上清を1,140 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清から細胞破片を除去します。透明化した上清を50mlのチューブに移し、4°C.
      で保存します。 注:5日目:
4. トランスフェクション後72時間で、ウイルス上清の2番目のバッチを回収します。手順2.3.1を繰り返し、プール48時間と72時間で上清が取り除かれました。
5. ウイルスを濃縮するには、30 mLの超遠心チューブを使用して、ウイルス上清を170,000 x gで4°Cで90分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、透明な上清がすべて遠心分離され、ウイルスの(見えない)ペレットと沈殿したPEIがチューブの底に残るまで、手順2.6を繰り返します。
7. ウイルスを再懸濁するには、500 μlのSATO培地 (表1を参照) を超遠心チューブに加えます。30秒間ボルテックスし、ピペットチップでチューブの基部をこすり落とし、ウイルスを機械的に緩めます。ウイルスペレットを失うために、この手順を6回繰り返します。
8. 再懸濁したウイルスを微量遠心チューブにプールし、非常に短時間回転させて不溶性PEIを除去します。0.45 μmフィルターで上清をろ過し、タンパク質を除去します。
9. ウイルスを20 μl、50 μl、および100 μlのアリコートに分注し、-80 °Cで保存します。

3. OPCの変換

一次
1. OPCをSATO培地(10 ml/10cmプレート)で、繊毛神経栄養因子(CNTF、10 ng/ml)、血小板由来成長因子(PDGF、10 ng/ml)、ニューロトロフィン3(NT3、1 ng/ml)、フォルスコリン(4.2 μg/ml)と共に、37 °C、8% CO₂、解剖後24時間培養します。
2. OPC培地を完全に吸引し、新たに調製したSATO培地(10 mL)に成長因子を添加します(上記のステップ3.1を参照)。
3. OPCにウイルスを最適濃度まで加え、OPCをさらに48時間培養します。

4. 髄鞘共培養のためのOPC播種(図2)

1. 表面からOPCを除去するには、まずOPCプレートを8 mLのEarle's Balanced Salt Solution(EBSS)で2回すすぎ、次に1:10に希釈した5 mLの温かい0.05%トリプシン-EDTAとEBSSで37°Cで2分間インキュベー
トします。
2. EBSS(5 mL)中の30% FBSでトリプシンを中和し、ピペッティングでプレートから細胞を除去します。細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、180 x gで室温で15分間遠心分離します。
3. 上清を吸引し、細胞ペレットを予熱したSATO培地1 mLに再懸濁し、続いて細胞数をカウントします。
4. OPC播種に先立ち、DRG培養プレートから培地を完全に吸引します。前述のように、200,000個のOPCをDRGニューロンに滴下します。
   手記：OPCの総播種量は、22 mmのカバースリップあたり200 μl未満である必要があります。
5. プレートを動かさずに組織培養フード内で細胞を10分間沈殿させた後、ウェルごとに1 mLの予熱済みSATO培地を静かに補充します。
6. 残りの姉妹OPCに、成長因子を含むSATO培地を再播種します(ステップ6.1を参照)。これらの姉妹OPCを使用して、目的のタンパク質の発現を確認します。
7. 24時間後、SATO培地をSATO培地(因子なし)および1%B2を含む神経基礎(v / v)を含む共培養培地(2 ml /ウェル)と交換します2〜3日ごとに培地を交換しながら、共培養を14日間維持します。
8. ウェスタンブロット解析によりミエリンタンパク質発現の共培養を評価し、ミエリン塩基性タンパク質マーカーおよびニューロンマーカーに対する抗体による二重免疫染色により、有髄軸索セグメントの形成を可視化します。

結果

>表 1.ストックソリューションの表。

名前	ざいりょう	筆記
TE バッファー pH 8	10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8	脱イオン水でメイクアップします。
ポリエチレンイミン(PEI)	1 g/L	脱イオン水でメイクアップし、フィルター滅菌し、ストックを-20°Cで保存します。
LBミディアム	20 g トリプトン 10 g...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2K7レンチベクター			スーター博士からの親切な贈り物
5-フルオロ-2′-デオキシウリジン	シグマ・アルドリッチ	F0503-100mg
アンピシリン	シグマ・アルドリッチ	A9518-5Gの
B27 - NeuroCul SM1 ニューロンサプリメント	幹細胞技術	5711
BDNF(人間)	ペプロテック	PT450021000
ビオチン(d-ビオチン)	シグマ・アルドリッチ	B4639
BSAの	シグマ・アルドリッチ	A4161(英語)
クロラムフェニコール	シグマ・アルドリッチ	C0378-100G
CNTF	ペプロテック	〒450-13020
DAKO蛍光封入剤	だこ	S302380-2
DMEM、高グルコース、ピルビン酸、グルタミンなし	ライフテクノロジー	10313039
DNase	シグマ・アルドリッチ	D5025-375KU
DPBSの	ライフテクノロジー	14190250
DPBS、カルシウム、マグネシウム	ライフテクノロジー	14040182
EBSSの	ライフテクノロジー	14155063
エコリフ	NEBの	R3101
プロモーターおよび目的遺伝子のエントリーベクター			プロトコル 1 〜 2 に従って生成
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	12003C
フォルスコリン	シグマ・アルドリッチ	F6886-50MG
グルコース(D-グルコース)	シグマ・アルドリッチ	G7528
グリセロール	ケムサプライ	GL010-500M	ストックソリューションを見る

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