マウス脳からの蛍光標識ニューロンの単離

要約

出典: Paul, A., et al., Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、マウスの脳から蛍光標識されたニューロンを分離する方法を示しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 蛍光標識マウスニューロンの手動選別

1. ガラスマイクロキャピラリー(材料の表を参照)を、次の設定のキャピラリープーラーを使用して出口直径10〜15μmまで引き抜きます:熱:508、プル:ブランク、vel:ブランク、時間:ブランク。
2. 120〜150 cmのフレキシブルシリコンチューブ(内径~0.8 mm)を、0.2 μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンシリンジフィルターと、適切なチューブコネクタを使用して双方向チューブバルブに取り付けます。
3. 500 mLの冷やした(4°C)人工脳脊髄液(ACSF、表1)を調製し、5%二酸化炭素バランス酸素をエアストーンにバブリングして酸素化します15分間または溶液が完全に透明になるまで
。
4. 150 mLのビーカーにアクティビティブロッカーのカクテルを入れた100 mLのACSFを調製します(表1)。
5. 150 mLビーカーに1 mg / mL連鎖球菌フラクションIVプロテアーゼを含む100 mLのACSFを調製します(表1)。.
6. 150mLのビーカーに1%ウシ胎児血清(FBS)溶液を含む100mLのACSFを調製し、エアストーンを介して5%二酸化炭素バランス酸素で酸素化します。
7. 安楽死させたマウスから脳を解剖するには、小さなハサミで頭蓋を開き、皮質を傷つけずに細かい鉗子を使って新鮮な脳を取り出します
   手記： あらゆる系統、年齢、性別のマウスを必要に応じて使用できます。ウイルスやその他の危険/感染性物質を注射したマウスで脳を凍結したり、手動で選別したりしないでください。
8. 脳を冷やして酸素化されたACSFに保ち、切片化の全期間中、5%の二酸化炭素バランス酸素にエアストーンを取り付けたままにします。
9. ビブラトームチャックに脳を配置し、冠状または矢状切片を300μmの厚さで切断します。必要な切片をできるだけ多く集めて、最低~10〜50個の標識細胞から数百個の細胞まで取得します。綿メッシュのスライスホルダーにスライスを置き、ビーカーの中に入れて、酸素化されたACSFに浸します。
10. 新鮮なスライスをACSFを含むビーカーにアクティビティブロッカーを入れ、室温で15〜20分間ブロックします。エアストーンを使用して酸素を泡立て続けます。
11. スライスをプロテアーゼ溶液を含むACSFを含むビーカーに移し、室温でマイルドな消化を行います:P4-14動物の場合は20〜30分、P28-56動物の場合は最大45〜60分。酸素を泡立て続けます。
12. ACSFを含むビーカーにスライスを戻して、活性ブロッカー溶液を含むACSFに室温で5〜10分間戻して、ACSFをプロテアーゼで洗い流します。酸素を泡立て続けます。
13. 室温で1% FBSを含むACSFを含む100 mmシャーレに個々の切片を移動します。蛍光解剖スコープの下で、最小10〜50細胞(最大数百)の細胞を持つ目的の領域と層をマイクロダイセクションします。一対の細い鉗子を使用するか、22〜28Gの注射針を木製ホルダー(串)に取り付けて、マイクロダイセクションを行います。
14. パスツールピペットを使用して、マイクロダイセクションしたピースを、ACSF溶液中に~0.8 mLの1% FBSが入った2 mLのマイクロチューブに移します。
15. 解剖した組織を室温でマイクロチューブ内で粉砕します。出口径が小さくなった3つの長い茎のパスツールピペットを直火で転がして作ります。各ピペットで、最大のものから始まり、最も小さいものまで、~10ストロークを実行します。
16. 解離した細胞を、酸素化されたACSFを含む100 mmのペトリ皿に分注します(ペトリ皿は、必要に応じて5 mmの1%寒天または透明なシリコーン化合物で1:10の比率で薄くコーティングできます)。室温で保管してください。
17. 細胞が徐々に落ち着くまで5~7分待ってから、解剖顕微鏡でGFP/RFPシグナルを観察します
    手記：単一細胞、破片、および小さな塊は、明視野(BF)で見ることができます。
18. フレキシブルシリコンチューブ(内径0.4〜0.8 mm)に取り付けられたキャピラリーピペット(ステップ1.1から)を使用して、一度に10〜15個のGFP/RFP細胞をピックし、新鮮な酸素化ACSFを含む100 mmのシャーレに細胞を分注します。
19. チューブバルブの端を舌で塞ぐことにより、キャピラリーを目的の細胞の近くに配置します。ブロックをリリーフする際に毛細管現象を使用して細胞を捕捉し、余分な液体がピペットに入るのを防ぐために迅速に再度ブロックします。解剖顕微鏡の蛍光光学系下で毛細管先端を観察しながら、新鮮な酸素化ACSFを静かに吹き付けて、100mmのシャーレに細胞を分注します。合計で100~150個の細胞を集めることを目指します。
20. ステップ 1.19 を 1 回または 2 回繰り返し (デブリによって異なります)、合計 ~50 ~ 75 個のセルを新しい 100 mm シャーレに移し、明視野微分干渉コントラスト (DIC) 光学系でデブリなどの汚染物質が最小限に抑えられていることを確認します。

>表 1: ソリューションとバッファーの一覧。

名 名 名 の

バッファ	アイテム	濃度	量(μL)
サンプル収集バッファー	組換えリボヌクレアーゼ阻害剤		55
	RCCの	1:50K 希釈	110
	ヌクレアーゼフリー水		605
	上記の43.75 μLを16本のチューブ(8本入り2本、PCRチューブ200本)に分注します。チューブごとに以下を追加
	UMIプライマー(N10B1-N10B16など)	1 ng/μL	6.25μL/チューブ
	各チューブの最終容量50μL(各チューブは25μLアリコートに分割し、-80°Cで凍結可能)
ソリューション：	アイテム	濃度	量
CSF:5Lを溶解させる	NaCl	126 mM	36.8 グラム
	KClの	3メートル	1.15グラム
	NaH2PO4	1.25 mM	0.75グラム
	NaHCO3	20 mM	8.4 グラム
	500 mLのACSFに、酸素を10〜15分間泡立ててから、毎回次の新鮮なものを追加します。
	D-グルコース	20 mM	1.8グラム
	MgSO4	2 mM	4 Mストックから0.5 mL
	CaCl2	2 mM	4 Mストックから0.5 mL
	ACSFを酸素化し続けます
ソリューション：	アイテム	>濃度
アクティビティブロッカーカクテル:100倍の株を作る
	ACSF100mLに添加
	APVの	0.05 mM
	CNQXの	0.02 mM
	TTXの	0.0001 mM (0.1 μM)
ソリューション：	アイテム	量
プロテアーゼソルション(100 mL)	Streptomyces griseus由来のプロテアーゼ	100ミリグラム
ウシ胎児血清:市販のソース、各使用で500μLのアリコート。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DL-AP5	トクリス	カタログ番号# 0105
CNQXの	トクリス	カタログ番号# 1045
TTXの	トクリス	カタログ番号# 1078
Streptomyces griseus由来のプロテアーゼ	シグマ・アルドリッチ	カタログ番号# P5147
カルボゲン	エアガス	カタログ番号# UN3156
シルガード184	シグマ・アルドリッチ	Cat# 761036
DIC光学系による蛍光と明視野照明を備えた解剖顕微鏡。(ライカモデルMZ-16F)。	ライカ	モデルMZ-16F
ガラスマイクロキャピラリー:ホウケイ酸キャピラリーチューブ500 / pk.OD=1 mm、ID = 0.58 mm、壁= 0.21 mm、長さ= 150 mm。	ワーナーインストゥルメント	モデルGC100-15、注文#30-0017
キャピラリーピペットプーラー	サッターインスツルメンツ株式会社	P-97
ビブラトーム	サーモマイクロム	HM 650V
ビブラトームティッシュ冷却ユニット	サーモマイクロム	CU 65