オリゴデンドロサイト馴化培地の生成方法

要約

出典:Mazuir, E., et al.共培養実験用のオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイトコンディショニング培地の生成。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、オリゴデンドロサイト系統細胞からオリゴデンドロサイトコンディショニング培地(OCM)の生成を、培地への分子放出を促進するためにストレスを与えることによって示しています。成長因子、サイトカイン、その他の生理活性分子が豊富なこの培地をニューロン培養物に添加することで、オリゴデンドロサイト分泌因子がニューロンの生理機能や接続性に及ぼす影響についての知見を得ることができます。

プロトコル

1. OL系統(OL)細胞の採取と培養

>注:これらの手順は、無菌条件下で層流フードで実行する必要があります。

1. 振とうした翌日に、表1に従ってボッテンシュタイン・サトウ(BS)培地を準備します。
2. コーティングされたペトリ皿を滅菌蒸留水で3回すすぎます。
3. 主にOL系統細胞を含むフラスコの上清を採取し、いくつかのミクログリア細胞も含み、コーティングされていない100mmシャーレにプレートします.
   手記：このステップにより、皿表面への差動高速接着により、ミクログリア細胞を除去できます。
4. ペトリ皿を加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂未満で15分間インキュベートします。
5. 各T150フラスコに25 mLの温かく調製した培地を入れ、加湿インキュベーターで5% CO₂の37°Cで2回目の振とうまでインキュベートします。
6. ペトリ皿から上清を新しいコーティングされていない100mmペトリ皿に移し、残留ミクログリア細胞の接着を可能にします。
7. ペトリ皿を加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂未満で15分間インキュベートします。
8. 非接着性OL系統細胞を含む上清を取り除き、50mLチューブに移します(50mLチューブの場合は2つのシャーレから上清)。ミクログリアを盛り付けたペトリ皿を捨てます。
9. 上清を423 x gで5分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを1 mLのBS培地で再懸濁します。すべてのペレットを共通の50 mLチューブにプールし、BS培地で容量を10 mLに調整します。
10. 顕微鏡で細胞をカウントして細胞密度を測定します.
    手記： 細胞密度は 3 x 10⁵ 細胞/mL から 5 x 10⁵ 細胞/mL の間である必要があります。
11. 細胞密度が4 x 10⁵細胞/mL以上の場合は20 mLのBSを添加して最終容量を30 mLに、細胞密度が4 x 10⁵細胞/mL未満の場合はBSを10 mLのみ追加して最終容量を20 mLにしてください。
12. プレコートされた100 mmシャーレを2つまたは3つ、10 mLの細胞懸濁液でプレートします。加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂未満でインキュベートします。
13. 2時間後にすべてのBS媒体をリフレッシュすることにより、ペトリ皿から破片を取り除きます。
    手記： 透明化の前後に顕微鏡で培養物を検査し、細胞密度と破片除去の効率を確認します。
14. 加湿インキュベーター内のBS培地で37°C、5%CO₂.
    で2日間インキュベートします 手記：顕微鏡で培養物を調べます。合流点は 70% から 80% である必要があります。

2. OCMの生産

>注:これらの手順は、無菌条件下で層流フードで実行します。

1. 表2に従ってNB-B27lowミディアムを準備します。
2. 10 mLの温かいNB-B27low培地で培地を更新します。加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂未満で2日間インキュベートします。
3. OCM、すなわちOL分泌因子を含む上清を採取します。0.22 μm filter.
   を使用して OCM をフィルター滅菌します。 手記：OCMは4°Cで最大2ヶ月間保存してください。

>表1:ボッテンシュタイン・サトウ(BS)メディアの準備。

ボッテンシュタイン・サトウ(BS)メディア	最終濃度
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム
ペニシリン-ストレプトマイシン	100 IU/mL
apo-トランスフェリンヒト	100 μg/mL
BSA(ウシ血清アルブミン)	100 μg/mL
インスリン	5 μg/mL
PDGFの	10 ng/mL
プロゲステロン	62 ng/mL
プトレシン二塩酸塩	16 μg/mL
亜セレン酸ナトリウム	40 ng/mL
T3 (3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩)	30 ng/mL
T4(L-チロキシン)	40 ng/mL

>表2:NB-B27lowおよびNB-B27メディアの準備。

NB-B27 ローメディア	最終濃度
神経基礎
B27サプリメント	0.5倍
L-グルタミン	0.5 mM
ペニシリン-ストレプトマイシン	100 IU/mL
NB-B27 のメディア	最終濃度
神経基礎
B27サプリメント	1倍
L-グルタミン	0.5 mM
ペニシリン-ストレプトマイシン	100 IU/mL

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント	サーモフィッシャー	17504044
D-(+)-グルコース溶液	シグマ	G8769
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	サーモフィッシャー	31966021
エタノール 100%	シグマ	32221-メートル
エタノール 70%	VWRケミカルズ	83801.36
子牛胎児血清	サーモフィッシャー	10082147
神経基礎	サーモフィッシャー	21103049
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャー	A1285601
ポリエチレン(PEI)	シグマ	P3143
ボッテンシュタイン・サトウ(BS)メディア
apo-トランスフェリンヒト	シグマ	T1147
BSA(ウシ血清アルブミン)	シグマ	A4161(英語)
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	サーモフィッシャー	31966021
インスリン	シグマ	I5500
PDGFの	ペプロテック	AF-100-13A
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
プロゲステロン	シグマ	P8783
プトレシン二塩酸塩	シグマ	P5780
亜セレン酸ナトリウム	シグマ	S5261
T3 (3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩)	シグマ	T6397
T4(L-チロキシン)	シグマ	T1775
ツール
0.22μmフィルター	ザルトリウス	〒514-7010
1 mLシリンジ	テルモ	1611127
100mmシャーレ	ダッチャー	193100
15mLチューブ	コーニング ライフサイエンス	734-1867
50mLチューブ	コーニング ライフサイエンス	734-1869
60mmシャーレ	ダッチャー	67003

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