神経細胞培養のためのコラーゲン被覆コンパートメント培養皿の調製

要約

出典:Zepecki, J. P., et al.後根神経節軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒト神経膠腫細胞の移動のリアルタイムモニタリング。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、コラーゲンと非反応性グリースを使用して3コンパートメントの細胞培養システムを構築する方法を示します。このシステムは、神経膠腫細胞と軸索の間の相互作用をリアルタイムで観察するために使用されます。

プロトコル

1. ラット背根神経節(DRG)、オリゴデンドロサイト(OPC)、およびhGC(ヒト神経膠腫細胞)のコンパートメント培養

1. コンパートメント化された培養皿の準備

>注: DRGの計画収穫の数日前に、次の手順を実行してください。

1. コンパートメント化された培養皿を組み立てます。
2. コラーゲンストック溶液を滅菌蒸留H₂O中で500 μg/mLに希釈し、よく混合する。
3. 滅菌トランスファーピペットを使用して、35 mmの培養皿に2 mLのコラーゲン溶液を満たし、溶液を取り出して薄いコラーゲン膜を残し、次の35 mm皿に入れます。このプロセスを繰り返し、必要に応じてコラーゲン溶液を追加し、すべての皿がコーティングされるまで繰り返します。
4. すべてのプレートがコーティングされたら、プレートを245 mm x 245 mmの培養トレイに置き、トレイの中央に3つの1 mm x 1 mmガーゼパッドを置きます。
5. コラーゲンを重合するには、ガーゼパッドを1 mLの濃水酸化アンモニウムで濡らし、トレイを15分間覆います。
6. ガーゼパッドを取り外し、35mmの皿を層流フードで乾かします。
7. 皿が乾いている間に、シリンジグリースアプリケーターのバレルに高真空グリースをセットします。コンパートメント化されたチャンバーを、蒸留水で満たされた大きな口のメディアボトルに入れます。.両方をオートクレーブ滅菌し、冷まします。
8. 18-Gの針の先端をやすりで削り、鈍い先端を作ります。70%エタノールで滅菌します。針をグリースシリンジに取り付けます。
9. ピンレーキを70%エタノールに浸して滅菌し、層流フードで風乾させます。
10. コラーゲンをコーティングした乾燥した35mmの皿から蓋を取り出します。親指と人差し指で皿を持ちます。もう一方の手でピンレーキを持ちます。しっかりと圧力をかけると、皿の中央に200μM幅の傷ができます。
11. 牧草地のピペットを使用して、スクラッチの中央にSupplemented Neuronal Basal Mediumを2滴垂らします。
12. すべての皿に傷がつくまで、手順1.1.10〜1.1.11を繰り返します。
13. コンパートメント化されたチャンバーを層流フードで乾燥させます。
14. 滅菌止血鉗子を使用して、中央の仕切りで1つのコンパートメントチャンバーをつかみます。止血鉗子を裏返して、チャンバーの底が上を向くようにします。
15. コンパートメントチャンバーの上部からシリコングリースを塗布します。グリースがきちんと配置され、すべてのコーナーで重なっていることを確認してください。
16. 35mmの皿から蓋を外します。皿をひっくり返し、引っかき傷をチャンバーの上に置きます。鉗子でプレートの底を軽くたたきます。
17. 止血鉗子を使用してプレートをそっと裏返します。鉗子を離します。
18. 中央のコンパートメントの基部にグリースの山を置きます。各チャンバーにSupplemented Neuronal Basal Medium(NB)を充填し、漏れがないか確認します。必要に応じて、漏れをシリコングリースでシールします。
19. すべての培養皿を組み立て続け、37°C、5%CO₂で一晩保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養ディッシュ	コーニング	430165	35mm×10mm
皮下注射針、18G	BDの	511097
水酸化アンモニウム溶液	フィッシャーサイエンティフィック	A669-500	耑
細胞培養ディッシュ	コーニング	430165
カンペノ商工会議所	タイラー・リサーチ	キャンプ-10
止血鉗子	ロボズ	RS-7035
カルトレックスラットコラーゲンI.	トレビゲン	3440-100-01
ピンレーキ	タイラー・リサーチ	キャンプPR
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャー	21103049
シリコングリース
金属ヤスリ
盤
ガーゼ
CO2インキュベーター
ガラス製ピペット