ニワトリ胚からの頭蓋神経襞の単離による神経堤細胞培養

要約

出典:Jacques-Fricke, B. T., et al. ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の調製と形態学的解析。J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオは、ニワトリ胚の中脳領域から脳神経襞を分離する技術を示しています。神経襞の詳細な解剖過程、その配置、およびフィブロネクチン被覆ガラスへの付着を示し、続いて神経襞からの神経堤細胞の移動を観察します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 溶液と材料の準備

1. 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl₂、4.96 mM KCl、0.809 mM Na₂HPO₄、および0.147 mM KH₂PO₄を混合して、リンゲル溶液を調製します(材料表を参照)。pHを7.4に調整し、100mLのボトルにろ過滅菌します。清潔で乾燥した場所に保管してください。ボトルを石鹸で洗わないでください(ティッシュカルチャーガラス製品として扱います)。
2. 1 mg/mLのストック溶液フィブロネクチン(FN)(材料表を参照)を無菌リンゲル溶液に溶解して調製し、-80°C(少なくとも4年間安定)で100 μLアリコートで保存します。
3. L15培地に0.8%のL-グルタミン、0.08%のペニシリン/ストレプトマイシン、10%のFBS、および10%のニワトリ胚抽出物を添加して、完全な培地を調製します。3 mLのアリコートを作成し、-20 °Cまたは-80 °Cで保存します
   手記：培養物を_CO2インキュベーターでインキュベートする場合、DulbeccoのModified Eagle Medium F12(DMEM/F12)をL15に置き換えて、空気用に緩衝する必要があります。
4. ろ紙サポートフレーム(約1cm×1.5cmの長方形の用紙に、長軸上に2つまたは3つのパンチ穴が重なるようにしたもの)を準備します。
   1. 一般的な3穴パンチを使用して大きな濾紙の端に沿って穴を開け、打ち抜いた端をストリップにカット/トリミングし、穴の間のストリップを長さ~1.5cmの長方形にカットします。使用前にオートクレーブ濾紙を使用してください(オプション)。
5. 細かい鉗子(#5)、鈍い鉗子、解剖はさみ、ばねはさみ、鋭利なタングステン針などの解剖ツールを集めます。

2. 培養皿の準備

1. ダウンストリームアプリケーションに適したニューラルフォールド培養ディッシュ(材料表を参照)を選択します。
   1. 固定して染色する培養物には、マルチウェル組織培養皿に入れたガラスカバースリップを使用してください。
      手記：ウェルサイズに一致するカバースリップは、液体の混合による動きが少なくなり、外植片が移動しにくくなり、ディッシュの底ではなくカバースリップに付着する可能性が高くなります。
   2. 倒立顕微鏡によるライブイメージングには、ガラス底のシングルチャンバーディッシュまたは分割チャンバーディッシュ(材料の表を参照)を選択します。
   3. 正立顕微鏡または実体顕微鏡でのライブイメージングには、光学的に適切な6ウェル、12ウェル、または24ウェルの組織培養プレートを使用してください。
   4. 移動性神経堤細胞の大量コレクションには、ハイスループット分析用のプラスチック組織培養皿をお選びください。
2. 10 U/mL のペニシリンと 10 μg/mL のストレプトマイシンを 100 mL の滅菌リンゲル液 (たとえば、100 μL の 10,000 U/mL ペニシリンと 10,000 μg/mL ストレプトマイシン) に加えて、リンゲルの P/S を作成します。RingerのP / Sは1週間以内に使用してください。
3. 1 mg / mLのFNのアリコートを氷上で解凍します。.リンガーP/SでFNの濃度10-100μg/mLに希釈します。
4. ウェルまたはディッシュの底を覆うのに十分なFN溶液をピペットで取ります。例えば、24ウェルプレートではウェルあたり100 μL、35 mmディッシュでは500 μLです。
5. 蓋を元に戻し、加湿インキュベーター(または蒸留水に浸したペーパータオルを敷いた蓋付きトレイ)で、神経襞を解剖しながら、38°C(100°F)で少なくとも1時間、皿またはプレートをFN溶液とインキュベー
トします。

3. 神経のひだを解剖する

1. リンガーのP / S溶液が入った清潔な皿に胚を移し、濾紙フレームを鉗子で保持し、胚の視界を遮る卵黄を静かに前後に振って胚を洗い流します。リンガーのP / Sを交換するか、曇った場合は新しい皿に移します。
2. 胚の背側/フレーム側を上にして、解剖顕微鏡の下に置きます。胚を紙のフレームに残してピンと張って所定の位置に保持し、鉗子を使用してビテリン膜を取り除き、神経のひだを露出させます
   手記：胚が紙のフレームから落ちた場合は、皿に平らに広げるか、シルガードコーティングされた皿にピンで留めて解剖することができます。
3. スプリングハサミまたは鋭利なタングステン針を使用して、中脳の神経折りを慎重に切除します。組織の尾側から拡張する視胞、吻側から菱形の狭窄が現れ始めたばかりの後脳まで含めます(心臓の三日月も有用な指標です、図1B、C)。神経回路の背側を切除するように注意し、神経管と非神経外胚葉の汚染を最小限に抑えます(図1C)。
4. P20ピペッターまたは卵黄質のリンガーP/Sですすいだ滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、神経のひだをリンガーのP / Sが入った清潔な皿に移します(これにより、プラスチックまたはガラスがブロックされ、組織が付着するのを防ぎます)。収集した折り目を氷上に保管し、追加の折り目を解剖します。

4. ニューラルフォールドのめっき

1. 完全培地のアリコートを解凍します(セクション1、ステップ3)。100 U / mLのペニシリンと100μg / mLのストレプトマイシンを加え、滅菌をろ過します。.調製した培地を37〜38°Cに保ちながら、他の手順を実行します。
2. インキュベーターから培養皿を取り出します(セクション2、ステップ5)。ピペッターまたはパスツールピペットを使用して、カバースリップ、皿、またはウェルからFN溶液を取り出します。FNコーティング基質をRingerのP/Sですすいだ後、ディッシュまたはウェルに適切な量の完全な培養培地を加えます(24ウェルプレートのウェルの場合は500 μL、35 mmディッシュまたは6ウェルプレートの場合は2 mL)
   手記：少量でも高価な試薬を保存することができますが(例:24ウェルプレートで200μL程度)、ディッシュが蒸発しないように十分に加湿されていることが保証されます。
3. p20またはp200ピペッターを使用して、まずピペットチップを卵黄リンガーのP / Sですすいでプラスチックをブロックし、組織が付着するのを防ぎます。次に、孤立した神経襞をFNコーティングされたカバースリップに移し、リンガーのP / Sをできるだけ少なく転送するように注意します。FNコーティングされたカバースリップの中央に向かって折り目を置きます。
   手記： 19mmウェルの12mmカバースリップに1つまたは複数の神経フォールドをメッキでき、35mmプレートに最大50個をメッキできます。
4. 外植片を10〜15分間沈殿させた後、38°C(100°F)の加湿チャンバーに、メッキされた神経折り目のある培養皿をゆっくりと慎重に運びます。これにより、ウェル内の神経折り畳みの移動が最小限に抑えられ、それらが分散したままでカバースリップに付着することが保証されます.
   手記：L15(DMEMではない)を使用する場合、外植片培養皿は、湿らせたペーパータオル付きの蓋付きトレイを使用して卵インキュベーターでインキュベートすることもできます。
5. 加湿インキュベーター内で神経フォールド培養物を活発な移動期間中(合計約16〜20時間、図2)インキュベートします。

結果

図 1. ニワトリ背側神経襞の解剖。Ringer's P/Sでは、スプリングハサミを使用して神経のひだを切除しました。(A)図の上部に向かって前方にある胚の背側図。神経のひだは、周囲の組織よりも不透明に見えます。中脳の神経襞は、視神経葉の後方(ピンク)と心臓の三日月の前(黄色)にあります。(B)神経襞が取り除かれた後の胚の背側図、切除境界を示す。(C)神経襞を取り除いた胚の側面図。解剖技術は、背側神経管を切除し、腹側および非神経管構造を回避します。(D)リンガーのP / Sの孤立した神経折り目スケールバー= 300μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ZEN 3.0 SRソフトウェアで制御するLSM710共焦点スキャンヘッドを搭載したAxioObserver	ツァイス		中古アルファプランアポクロマート 100倍/1.46 オイル DIC M27 対物レンズ
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C3306
チャンバーディッシュ(ガラス底、シングルまたは分割)	マテック;セル可視化	P35G-1.5-14-C(MatTek) X000NOJQGX(セルビス) X000NOK1OJ(セルビス)	シングルチャンバー35mmまたは4チャンバー35mm
カバーガラス	カロライナバイオロジカルサプライカンパニー	633029、633031、633033、633035、 633037	円、厚さ0.13〜0.17 mm、直径12〜25 mmで利用可能
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033	L15メディアの代替品
卵インキュベーター	スポーツマン	1502
FBSの	ライフテクノロジー	〒10437-028
フィブロネクチン	フィッシャーサイエンティフィック	CB-40008Aの
濾紙	ワットマン		グレード3MMクロマトグラフィー
鉗子(鈍器)	フィッシャーサイエンティフィック;トーマス・サイエンティフィック	08-890(フィッシャー);1141W97 (トーマス)
鉗子(細かい)	ファインサイエンスツール	11252から20	デュモン #5
ピンホルダー	ファインサイエンスツール	26016-12	タングステン針用(スプリングハサミの代替品)
KClの	シグマ・アルドリッチ	P3911
KH2PO4	シグマ・アルドリッチ	P0662
L15 メディア	インビトゲン	11415064
L-グルタミン	インビトゲン	25030
Na2HPO4	シグマ・アルドリッチ	S9638
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S9888
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-148	10,000単位/mLペニシリン;10,000mg/mLストレプトマイシン
ペトリ皿	VWR(または同等品)		60 mm、100 mm
ハサミ(解剖)	ファインサイエンスツール	14061-10
春はさみ	ファインサイエンスツール	15000から08	2.5 mm刃先(タングステン針の代替品)
シルガード	クレイデン	シルガード184
シリンジフィルター	シグマ・アルドリッチ	SLGVM33RS	Millex-GV シリンジフィルターユニット、0.22 μm、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌済み
組織培養皿	ザルシュテット	〒83-3900	バルク神経フォールド培養用の35 mm培養皿
タングステンワイヤー	さまざまな情報源		タングステン針の直径0.01インチ(スプリングハサミの代替品)

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