マウスの内耳からの前庭神経節ニューロンの分離

要約

出典:Iyer, M. R. et al., Isolturating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.J. Vis. Exp. (2023).

このビデオでは、マウスの子犬の内耳から前庭ニューロンを分離する方法を紹介しています。内耳の解剖、前庭神経節の採取、その後の神経節の解離を単一の細胞にすることに関連する手順を細心の注意を払って概説しています。次に、これらの細胞をガラス底皿で培養して、前庭ニューロン培養を確立します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 事前準備

>注:このセクションで説明する解決策とツールは、かなり前もって作成し、解剖と記録の日に使用することができます。

1. 10 mM HEPES(L-15溶液)を添加したLiebovitz培地を調製します。次の手順では、1 LのL-15溶液を作成する方法について説明します。
   1. 脱イオンしたH₂O990 mLを1つのビーカーに注ぎます。2.386 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。L-15溶液粉末1Lのボトルを1本追加します.
      注:粉末L-15は貯蔵寿命が長く、保管スペースを占有しません。または、L-15溶液を購入し、HEPESを補給します。後者のオプションには、蛍光イメージングに有用なフェノールフリー溶液を使用するオプションもあります。
   2. 攪拌板の上で溶液を攪拌します。pHメーターを使用して、1 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)をゆっくりと加え、pHを7.34〜7.36にします。
   3. 脱イオンしたH₂Oを、溶液が1,000 mLの容量に達するまで加えます。孔径0.22 μmのメンブレンを使用して溶液をろ過します.
      手記：L-15溶液は、4°Cで1〜2週間保存できます。フェノールレッド製のL-15を使用すると、塩基性すぎると溶液がピンク色になり(pH > 7.4)、酸性すぎるとオレンジ色(pH < 7.34)になります。
2. 前庭神経節ニューロン(VGN)の培地を調製します。以下の手順に従って、50 mLの培地を作成します。
   1. 47.5 mLのGluMAX-I最小必須培地を清潔なガラスビーカーに加えます。.
   2. 0.1194 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。この追加のバッファーは、細胞がインキュベーターに移動する前に沈殿する間、pHの変化に抵抗します。
   3. 2.5 mLのウシ胎児血清(FBS)を加えます。.これにより、50 mLの培地の総容量でFBSが体積で5%になります。
   4. 攪拌板の上で溶液を攪拌します。pHメーターを使用して、1 N NaOHをゆっくりと加え、7.38〜7.4のpHを取得します。
   5. 0.5mLのペニシリン-ストレプトマイシンを加えます。.0.22 μmの滅菌フィルターで溶液をろ過します。溶液は4°Cで保存します。
   6. 使用の少なくとも30分前に、培養培地を通気キャップ付きの組織培養フラスコに移します。フラスコを培地とともに、5%_CO2濃度のインキュベーターに37°Cで置きます。

2. トリチュレーションピペットの製作

>注:トリチュレーションピペットは複数の実験に再利用できます。毎回使用する前にピペットをエタノール、水、およびL-15溶液で洗い流し、各使用後に水とエタノールで洗浄します。使用の合間に慎重に保管してください。

1. 細胞解離のためのトリチュレーションピペットを調製するには、ガラス製のパスツールピペットをブンゼンバーナーの炎にかざします。ガラスの先端が溶け始めたら、ガラスを希望の先端の直径まで伸ばします。ピペットの一方の端を炎から引き離して、小さな曲がりを作ります。
2. 曲がったピペットを顕微鏡に近づけます。スコアリングタイルを使用して、希望の直径でグラスにスコアを付けて割ります。
3. ピペットの先端をブンゼンバーナーの炎の上に置きます。これにより、先端近くの粗いエッジがすばやく研磨されます。先端が炎で密閉されていないことを確認してください。
4. さまざまなサイズの4つまたは5つのピペットが準備されるまで、このプロセスを繰り返します。

3. 前庭神経節の摘出と前庭ニューロンのプレーティング

1. 解剖の準備
   1. L-15溶液と0.05%コラゲナーゼおよび0.25%トリプシンとの酵素混合物を調製します。例えば、0.001 gのコラゲナーゼと0.005 gのトリプシンを2 mLのL-15溶液にビーカーに加え、小型のマグネチックスターラーを加えて、完全に混合されるまで攪拌します。室温で取っておきます。
   2. 市販のギロチンを準備するには、ペーパータオルをギロチンの側面と下に置いて、ベンチトップやその他の表面が血液やその他の生物学的物質にさらされるのを最小限に抑えます。
   3. 大型のステンレス製ハサミ、大型の鉗子、大型のスプリングハサミを敷き詰めます。70%エタノールを入れた大きなスプレーボトルは、ヘッドクリーニングのために手元に置いておきましょう。
   4. 100mLのビーカーにL-15溶液を入れ、氷の上に置きます。L-15溶液を酸素化します。
   5. スプリングハサミ、手術用ハサミ、鉗子、メス、トランスファーピペットをレイアウトします(材料の表を参照)。
   6. 60 mmシャーレ(肉眼的解剖用)と2つの35 mmシャーレ(神経節の洗浄/細かい解剖用)を準備します。0.22 μmフィルターチップ付きの30 mLシリンジを使用して、60 mmディッシュに酸素化L-15溶液を充填します。
2. 安楽死、頭部洗浄、および半解剖
   1. 子犬の体重を量り、腹腔内投与に適した致命的プラス希釈液の適切な投与量を計算します(10 gあたり~0.01 mL)。
   2. つま先のつま先つまみに対する反応の欠如によって評価されるように、麻酔の深い平面に達したら、ギロチンを使用して首を切る。
   3. 頭部を70%エタノールで十分にすすいでから、L-15溶液で十分にすすいでください。
   4. 頭蓋骨から皮膚を完全に取り除きます。大きなスプリングハサミを使用して、脊髄の脳への入り口から始まり、頭蓋骨の上部をカットし、2 回目は顎の底をカットします。手術用ハサミを使用して頭を二等分し終了します。
   5. L-15溶液で満たされた60mmのシャーレに、頭の脳の両側を下にして置きます。現在解剖されていない新鮮な組織を氷の上に置きます。
3. 上前庭神経節の抽出
   1. 閉じた手術用ハサミを使用して脳をすくい取ります。脳神経を切断して切除し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。
      手記：この時点で、耳嚢(数字の8のような形)が後頭部に見えるはずです。
   2. 鉗子を使用して、後頭部から始めて、透明な膜状物質を引き抜きます。
   3. 手術用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。頭と首の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢をよりきれいでアクセスしやすくします.
      手記：手順全体で余分な組織を捨てることにより、皿が曇りすぎないようにしてください。
   4. 組織を新鮮なL-15溶液を入れた2番目のシャーレに移します。耳嚢と聴覚神経、上前庭神経、および下前庭神経を見つけます。聴覚神経を切り取り、小さなスプリングハサミを使用して上神経節と下神経節を分離します
      手記：前庭神経の体性体は下神経節(細い神経節)と上神経節(厚い神経節)の両方に見られますが、上神経節から抽出された細胞は生存率が高くなります。
   5. メスを使用して、骨の隆起をそっと削り取り、神経が骨嚢に潜る骨の領域を弱めます。細かい鉗子で破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。
   6. 細いスプリングハサミを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。
   7. 細い鉗子を使用して上神経節を取り除き、神経節組織に近づきすぎないように注意してください。新鮮なL-15溶液を入れた35mmのシャーレに移します。
   8. 先に進む前に、酵素溶液を予熱します:酵素混合物を35mmのシャーレに注ぎ、37°Cのインキュベーターに10〜15分間入れます。
   9. 細い鉗子と小さなスプリングハサミを使用して、骨(構造が白く結晶化しているように見える)、余分な組織、神経線維、およびその他の余分な構造を取り除き、神経節を清掃します。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。
4. 組織の解離とプレーティング
   1. 洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、10〜40分間インキュベーターに戻します。組織を酵素で過剰に処理すると、トリチュレーションの前に神経節が完全に溶解します.
      注:組織が酵素治療を受ける時間は、動物の年齢によって異なります。例えば、P9ラットの神経節を酵素で25分間処理し、P15ラットの神経節を酵素で35分間処理します。
   2. 神経節を新鮮なL-15溶液で35mmのシャーレに移し、2〜3分間インキュベートします。
   3. 神経節を、ろ過した培養培地で満たされた別の35mmシャーレに移します。
   4. 200 μLのマイクロピペットを使用して、ろ過した培地を~150 μL滴下し、コーティングされたガラス底皿にピペットで移します。ガラスカバーガラスの上に残る溶液の泡を形成するために表面張力を維持することが重要であるため、溶液を追加しすぎないでください。
   5. 必要な数の神経節(1〜4)をカバーガラスに移します。
   6. 培養皿から少量の培地を引き出し、トリチュレーションピペットを培地ですすいで、組織がガラスピペットの側面にくっつかないようにします。神経節が十分に解離するまで、組織をピペットに優しく繰り返し通すことにより、トリーツします。
      手記：組織を酷使して単一細胞懸濁液を試みたり、過度の陽圧を使用して細胞を皿の底に衝突させたりしないでください。また、気泡の形成は細胞の生存率を低下させるため、避けてください。穏やかなトリチュレーションは、細胞の生存を成功させるための鍵です。
   7. 細胞を5分間休ませ、細胞がカバーガラスに落ち着いたかどうかを光学顕微鏡で確認します。
   8. 培養皿を37°Cのインキュベーターに慎重に入れ、12〜24時間待ちます。繰り返しになりますが、溶液の泡をそのまま保つようにしてください.
      手記：24時間以上培養する場合は、毎日培地をリフレッシュしてください。これは、一時停止ポイントになる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント(50x)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044	培地用添加剤, SGN用
ビーカー(1000、100、10)ミリリットル
ベンチトップ遠心分離機	USAサイエンティフィック	〒2641-0016
ブンゼンバーナー
コラゲナーゼ	シグマ・アルドリッチ	C5318	組織を消化するための酵素の3つのうち1
カバーガラス、長方形、#1厚さ、22x40	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0707
DMSOの	ビオチウム	90082
Dnase I、ウシ膵臓由来	シグマ・アルドリッチ	11284932001	組織を消化するための酵素の3つのうち1
デュモン #3 鉗子(鈍器)	ファインサイエンスツール	11231から30
デュモン #5 鉗子 (ファイン)	ファインサイエンスツール	11251から10
デュモン #55 鉗子 (ファイン)	ファインサイエンスツール	11255から20
エタノール	デコンラボ	2716	ヘッドや解剖ベンチの周りの清掃用
電極用フィラメントホウケイ酸キャピラリー	サッターインストゥルメント	BF140-117から10
ファインエッジ解剖ブレード	ファインサイエンスツール	10010-00
ガラスパスツールピペット	VWRの	14673から010	トリチュレーションピペットを引くには
熱不活化ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16140063	培地への添加物
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-100G(英語版)	プロトコール内のすべての溶液をpH緩衝液
ホットプレート/マグネチックスターラー	VWRの	76549から914
氷で満たされた断熱バケツ			すべてのサンプルと溶液を冷却するために
大型スプリングハサミ	ファインサイエンスツール	14133から13
リーボヴィッツミディアム	シグマ・アルドリッチ	L4386	解剖および入浴ソリューション
培養皿用の薄型バス記録室	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0236
ルアーロックシリンジ、30 ml	BDの	302832	L-15/HEPES/HEPES溶液の描画用。
MEM + グルタマックスサプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	41-090-101	培地のベース
マイクロピペット充填用microFilニードル - 34ゲージ	世界の精密機器	MF34Gの
N2サプリメント(100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048	培地への添加剤, SGN用
NaOH (1 M)	トーマス・サイエンティフィック	319511-500ミリリットル	滴定用pH
酸素、医療グレード、適切なレギュレーターとチューブ付き	USCマテリアルマネジメント	MEDOX200 (識別子: 00015)	解剖液や浴液に溶解するため
パラフィルム	ビーミス	PM992
パスツールピペットバルブ(3 ml)	フィッシャーサイエンティフィック	03-448-25	トリチュレーションピペット用バルブ
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	培地の汚染を防ぐための添加剤
ペントバルビタールベースの安楽死溶液(例:Fatal Plus. 50 – 60 mg / kg投与)	MWIアニマルヘルス	15199	安楽死のために
PESメンブレンフィルター、0.2マイクロメートル	ナルゲン	〒566-0020	フィルタリングソリューション用
PESメンブレン滅菌シリンジフィルター、0.22 um、30 mm	セルトリート	229747	シリンジに引き込まれた溶液のろ過用
シャーレ、35 x 10 mm	ジェネシー・サイエンティフィック	32から103	マイクロダイセクション用、および穿孔パッチ構成のチップディップ溶液を保持するため
シャーレ, 60 x 15 mm	ミッドランドサイエンティフィック	P7455型	肉眼的解剖用
pHメーター	メトラー・トレド	モデルS20
ピペッター(1000、200、10)マイクロリットル	USAサイエンティフィック
ポリ-d-リジンコーティングガラス底培養皿	マテック	P35GC-0-10-Cの	培養用ニューロンのプレート化
クイックチェンジプラットフォーム、加熱ベース、35mm培養皿用	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0375
参照セル	世界の精密機器	RC1Tの
メスの刃	ミルテックス	4-315
メスハンドル	ファインサイエンスツール	10003-12
科学的なスケール	メトラー・トレド	XS64
セロジカルピペット(10、25)ミリリットル	フィッシャーサイエンティフィック
シリコーングリースキット(カバーガラスとチャンバーのシーリング用)	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0378
小動物ギロチン	ケントサイエンティフィック	DCAPの
小動物ギロチン	ケントサイエンティフィック	DCAPの	P15より古いラットを解剖する場合の斬首用。
実体解剖顕微鏡	ツァイス	ステミ 2000
ストレート手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14060から09
シリンジ(3、10、30)ミリリットル
トリプシン	シグマ・アルドリッチ	T1426	組織を消化するための酵素の3つのうち1
ツベルクリン注射器	コヴィディエン	8881500105	腹腔内注射による安楽死液の送達
バンナススプリングシザー、2.5mmカッティングエッジ	ファインサイエンスツール	15000から08
メスフラスコ、1000ミリリットル
渦動	VWRの	945300
水、滅菌液、R>18.18メガオームcm(例:ミリポアシグマ浄水システムでろ過)	ミリポアシグマ	CDUFBI001

つ つ 名 の つ