マウスの内耳からの前庭神経節ニューロンの分離

要約

出典:Iyer, M. R. et al., Isolturating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.J. Vis. Exp. (2023).

このビデオでは、マウスの子犬の内耳から前庭ニューロンを分離する方法を紹介しています。内耳の解剖、前庭神経節の採取、その後の神経節の解離を単一の細胞にすることに関連する手順を細心の注意を払って概説しています。次に、これらの細胞をガラス底皿で培養して、前庭ニューロン培養を確立します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 事前準備

>注:このセクションで説明する解決策とツールは、かなり前もって作成し、解剖と記録の日に使用することができます。

1. 10 mM HEPES(L-15溶液)を添加したLiebovitz培地を調製します。次の手順では、1 LのL-15溶液を作成する方法について説明します。
   1. 脱イオンしたH₂O990 mLを1つのビーカーに注ぎます。2.386 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。L-15溶液粉末1Lのボトルを1本追加します.
      注:粉末L-15は貯蔵寿命が長く、保管スペースを占有しません。または、L-15溶液を購入し、HEPESを補給します。後者のオプションには、蛍光イメージングに有用なフェノールフリー溶液を使用するオプションもあります。
   2. 攪拌板の上で溶液を攪拌します。pHメーターを使用して、1 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)をゆっくりと加え、pHを7.34〜7.36にします。
   3. 脱イオンしたH₂Oを、溶液が1,000 mLの容量に達するまで加えます。孔径0.22 μm....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント(50x)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044	培地用添加剤, SGN用
ビーカー(1000、100、10)ミリリットル
ベンチトップ遠心分離機	USAサイエンティフィック	〒2641-0016
ブンゼンバーナー
コラゲナーゼ	シグマ・アルドリッチ	C5318	組織を消化するための酵素の3つのうち1
カバーガラス、長方形、#1厚さ、22x40	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0707
DMSOの	ビオチウム	90082
Dnase I、ウシ膵臓由来	シグマ・アルドリッチ	11284932001	組織を消化するための酵素の3つのうち1
デュモン #3 鉗子(鈍器)	ファインサイエンスツール	11231から30
デュモン #5 鉗子 (ファイン)	ファインサイエンスツール	11251から10
デュモン #55 鉗子 (ファイン)	ファインサイエンスツール	11255から20
エタノール	デコンラボ	2716	ヘッドや解剖ベンチの周りの清掃用
電極用フィラメントホウケイ酸キャピラリー	サッターインストゥルメント	BF140-117から10
ファインエッジ解剖ブレード	ファインサイエンスツール	10010-00
ガラスパスツールピペット	VWRの	14673から010	トリチュレーションピペットを引くには
熱不活化ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16140063	培地への添加物
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-100G(英語版)	プロトコール内のすべての溶液をpH緩衝液
ホットプレート/マグネチックスターラー	VWRの	76549から914
氷で満たされた断熱バケツ			すべてのサンプルと溶液を冷却するために
大型スプリングハサミ	ファインサイエンスツール	14133から13
リーボヴィッツミディアム	シグマ・アルドリッチ	L4386	解剖および入浴ソリューション
培養皿用の薄型バス記録室	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0236
ルアーロックシリンジ、30 ml	BDの	302832	L-15/HEPES/HEPES溶液の描画用。
MEM + グルタマックスサプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	41-090-101	培地のベース
マイクロピペット充填用microFilニードル - 34ゲージ	世界の精密機器	MF34Gの
N2サプリメント(100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048	培地への添加剤, SGN用
NaOH (1 M)	トーマス・サイエンティフィック	319511-500ミリリットル	滴定用pH
酸素、医療グレード、適切なレギュレーターとチューブ付き	USCマテリアルマネジメント	MEDOX200 (識別子: 00015)	解剖液や浴液に溶解するため
パラフィルム	ビーミス	PM992
パスツールピペットバルブ(3 ml)	フィッシャーサイエンティフィック	03-448-25	トリチュレーションピペット用バルブ
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	培地の汚染を防ぐための添加剤
ペントバルビタールベースの安楽死溶液(例:Fatal Plus. 50 – 60 mg / kg投与)	MWIアニマルヘルス	15199	安楽死のために
PESメンブレンフィルター、0.2マイクロメートル	ナルゲン	〒566-0020	フィルタリングソリューション用
PESメンブレン滅菌シリンジフィルター、0.22 um、30 mm	セルトリート	229747	シリンジに引き込まれた溶液のろ過用
シャーレ、35 x 10 mm	ジェネシー・サイエンティフィック	32から103	マイクロダイセクション用、および穿孔パッチ構成のチップディップ溶液を保持するため
シャーレ, 60 x 15 mm	ミッドランドサイエンティフィック	P7455型	肉眼的解剖用
pHメーター	メトラー・トレド	モデルS20
ピペッター(1000、200、10)マイクロリットル	USAサイエンティフィック
ポリ-d-リジンコーティングガラス底培養皿	マテック	P35GC-0-10-Cの	培養用ニューロンのプレート化
クイックチェンジプラットフォーム、加熱ベース、35mm培養皿用	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0375
参照セル	世界の精密機器	RC1Tの
メスの刃	ミルテックス	4-315
メスハンドル	ファインサイエンスツール	10003-12
科学的なスケール	メトラー・トレド	XS64
セロジカルピペット(10、25)ミリリットル	フィッシャーサイエンティフィック
シリコーングリースキット(カバーガラスとチャンバーのシーリング用)	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0378
小動物ギロチン	ケントサイエンティフィック	DCAPの
小動物ギロチン	ケントサイエンティフィック	DCAPの	P15より古いラットを解剖する場合の斬首用。
実体解剖顕微鏡	ツァイス	ステミ 2000
ストレート手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14060から09
シリンジ(3、10、30)ミリリットル
トリプシン	シグマ・アルドリッチ	T1426	組織を消化するための酵素の3つのうち1
ツベルクリン注射器	コヴィディエン	8881500105	腹腔内注射による安楽死液の送達
バンナススプリングシザー、2.5mmカッティングエッジ	ファインサイエンスツール	15000から08
メスフラスコ、1000ミリリットル
渦動	VWRの	945300
水、滅菌液、R>18.18メガオームcm(例:ミリポアシグマ浄水システムでろ過)	ミリポアシグマ	CDUFBI001

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