$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 組織の解離
>注:以下のすべての手順は、無菌技術と滅菌材料を使用して、バイオセーフティキャビネットに指定された滅菌組織培養で実行されます。
- 0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシン1 mLを、9 mL DMEMおよび組織の各15 mLコニカルチューブに加えて、組織溶解を開始します
手記：DMEMには塩化カルシウムが多く含まれており、トリプシンの阻害剤として作用する可能性があります。概説された手順に従って解離が完了しない場合は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクスのバランスの取れた塩溶液を使用できます。トリプシン化後、酵素はトリプシン阻害剤を添加することで中和できますが、カルシウムはDNase Iの補因子であるため、溶液に戻す必要があります。これは後続のステップで使用されます。
- 10mLピペットで約20回回転させます。
- 細胞懸濁液を空の50mLコニカルチューブに移します。
- 溶液を37°C、5%CO2で15分間インキュベートし、8分後にライセートを穏やかに撹拌します。
- 5 mLのMGMと200 μL(5 mg/mL)DNase Iを各チューブに加えると、最終濃度が50 μg/mLになります。
- 各ライセートを10 mLピペットで10x滴定します。
- 細胞懸濁液を室温で3分間放置し、解離していない組織がチューブの底に沈殿するのを待ちます。
- 細胞懸濁液を新しい50 mLコニカルチューブに移し、解離していない組織を残します
手記：上述の溶解およびトリチュレーションステップは、非解離組織の量を大幅に制限します。
- チューブを300 x gで4°Cで3分間、ブレーキなしで遠心分離します。
- 上清を吸引し、残りの細胞ペレットを5 mLのMGMに再懸濁します。
- 5mLピペット20xでペレットを粉砕します。
- 5 mLの細胞懸濁液をコーティングしたT25フラスコにプレートします。
- 細胞を37°C、5%CO2でインキュベートし、24時間後に最初に培地を交換して細胞破片を除去します
手記：一部のプロトコルでは、72 時間後に最初のメディア交換を行うことを推奨しています。この手順の最適化が必要になる場合があります。
- 細胞が80%コンフルエントになるまで(約5〜7日)、48〜72時間ごとにMGMで100%培地交換を行います
注:メディアを交換する前に、すべてのメディアを37°Cに温める必要があります。
2. オリゴデンドロサイト前駆細胞の単離
初期分離後にOPCをめっきする場合、ポリD-リジンコーティングされた表面(滅菌プレートまたはカバーガラス)にOPCをめっきする必要があります。このセクションを完了する前に、これらの資料を準備してください。
- 15時間振った後、フラスコから上清を取り除き、滅菌済みの100mmシャーレでプレートします。
- 上清を37°C、5%CO2で30分間インキュベートし、15分後に渦巻き状にすることで、残りのミクログリアが皿に非常に迅速に付着するため、これらを除去します。このステップには、非組織培養処理されたペトリ皿を使用してもよい。
- 非接着性の細胞上清、カウント、およびポリ-D-リジンコーティングされた表面上のプレートを取り除きます。通常、7,500〜10,000個のOPCがメッキされています/cm2。
- 37°C、5%CO2で少なくとも1時間(最大6時間)インキュベートした後、培地の95%を穏やかに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、培地をウェルの壁にピペッティングしてOPCの混乱を最小限に抑えます。細胞が使用できるようになるまで、48時間ごとに培地を交換してください。
注:一度に1つのウェルのみを変更することが重要です。OPCは敏感で、特に乾燥した条件には耐性がありません。OPC培地にPDGF-AAを添加すると、OPCのオリゴデンドロサイトへの成熟が遅れます。この因子は、実験の焦点が成熟オリゴデンドロサイトである場合、培地から除外できます。
>表 1: バッファーとメディアのレシピ。
混合グリアメディア(MGM)
| 88ミリリットル | 1X DMEM (高グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸Naを含む) |
| 10ミリリットル | ヒートインアクティベートFBS |
| 1.0ミリリットル | L-グルタミン (100X) |
| 1.0ミリリットル | 抗生物質/抗真菌薬 |
OPC培地(50mL)
の
| 49ミリリットル | 神経基礎培地 |
| 1.0ミリリットル | B27サプリメント(50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| >注:PDGF-AAは、各メディアの変更前に新たに追加されます。 |