ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを作製する技術

要約

出典:Boisvert, E. M., et al. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp (2020).

このビデオでは、ヒト胚性幹細胞(hESC)から脳オルガノイドを生成する技術を示しています。hESCコロニーの付着培養物は、酵素で処理して分離し、クラスターに分解します。これらのクラスターは懸濁液中で3次元の球体を形成し、ニューロンとグリア細胞の層を持つ脳皮質を模倣するオルガノイドに分化するように誘導されます。

プロトコル

1. 幹細胞の維持

1. 製造元の指示に従って、成長因子を減少させた基底膜マトリックス(材料表を参照、以下単にマトリックスと呼ぶ)の層上にH9 hESCを維持します。
   1. 6ウェルプレート1枚または10 cmディッシュ1枚をコーティングするには、100 μLのマトリックスと5.9 mLの氷冷ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12培地を組み合わせます。プレートをパラフィンフィルムで包み、4°Cで一晩保存し、翌日、余分なマトリックス/培地を吸引した後の細胞の継代に使用します。
2. 細胞を7日ごとに約1:12の分割比で毎週培養します。mTESR-1培地を使用して、37°Cの低酸素インキュベーター(5%O₂、5%CO₂)で細胞を維持します。メディアを毎日更新します。ガラスツールを使用して、継代間の培養から分化細胞を取り除きます。
3. H9細胞は、オルガノイドを作製するために利用する4〜6日前に継代する必要があります。細胞は、細胞クラスターの約1:8の比率で継代する必要があります。これを行うには、まず、ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)培地で細胞をすすぎ、細胞を中性プロテアーゼ(例えば、ディスパーゼ、以下、単にプロテアーゼと呼ぶ)で解離し、DMEM/F-12ですすぎ、4つのプレート(6ウェルまたは10cm)に30-60個の細胞クラスターを~20%の密度でプレートします。収穫の2日前に、それらを通常のインキュベーター(21%O₂、5%CO₂)に移します。オルガノイド形成を開始すると、プレートは~80%のコンフルエントに達する必要があります。

2. オルガノイド培養におけるhESCの解離

1. プロテアーゼストック溶液(5 U / mL)を分注します.
   手記： 通常、1 mLのアリコートを-20°Cで凍結して数か月にわたって使用します。
2. hESCの6ウェルプレートまたは10cmプレートごとに1 mLのストック溶液と5 mLのDMEM/F12を添加して、プロテアーゼストック溶液を使用濃度に希釈します。
3. 細胞培養培地を吸引して除去し、hESCをプロテアーゼ溶液で覆います。プレートをインキュベーターに10〜15分間、またはコロニーの端が切り詰められてマトリックスから分離し始めるまで置きます。
4. プレートを傾け、プロテアーゼ溶液を吸引し、DMEM/F12で細胞を3回穏やかに洗浄します。6ウェルプレートを使用する場合は各洗浄に2 mL/ウェルを、10 cmプレートを使用する場合は6 mL/ウェルを使用してください。この手順を実行するときは、コロニーがマトリックスに付着したままであることを確認してください。
5. 約1.5 mLの新鮮なmTESR培地を各ウェル(10 cmプレートの場合は5 mL)に加え、穏やかなピペッティングを使用して細胞をプレートから洗い流します。
6. 10 mLピペットを使用して、hESCが元のサイズの約1/30に達するまで、プレート内でhESCを穏やかに吸引して分注します。コロニークラスターは、これらのステップの完了時に~250〜350μmサイズの正方形に似ているはずです。

3. オルガノイドの生成

1. 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含まない30 mLのmTESR培地を含む単一の超低接着T75フラスコに細胞を移します。
2. 翌日、生細胞が隅に溜まるようにフラスコを傾けます(初日は5〜10分かかる場合がありますが、クラスターが大きくなるにつれて速くなります)
   手記：このステップまたは後続のステップでフラスコの底に付着した細胞が多数ある場合は、細胞を新しいフラスコに移します。最初の2日間は死細胞の集団が多いのが普通です。培地交換を行うときは、細胞の破片をできるだけ多く取り除いてください。
3. 細胞が落ち着いたら、培地と死細胞を吸引し、生細胞を含む培地を約10mL残します。
4. ~20 mL の低 bFGF 培地 (DMEM/F12 に 1x N2、1x B27、1x L-グルタミン、1x 非必須アミノ酸 (NEAA)、0.05% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 0.1 mM モノチオグリセロール (MTG) に 30 ng/mL bFGF を添加) を加えます。
5. 2日目の細胞を確認してください。ほとんどの細胞が健康で明るく見える場合は、何もする必要はありません。ただし、細胞の 3 分の 1 以上が暗く見える場合は、培地を (ステップ 3.2 と同じ傾斜技術を使用) 20 ng/mL の bFGF を添加した ~20 mL の低 bFGF 培地と交換します。
6. 3日目に、培地の半分(ステップ3.2のチルト法を使用)を、10 ng/mL bFGFを添加した20 mLの低bFGF培地と交換します。
7. 5日目に、培地の半分(ステップ3.2の傾斜法を使用)を20mLの神経誘導培地(NIM:DMEM/F12、1x N2サプリメント、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mLヘパリン)と交換します
   手記： 他の細胞よりもはるかに大きい細胞またはオルガノイドの大きなクラスターがある場合は、それらを培養物から取り除く必要があります。サイズは顕微鏡下での外観によって推定されます。たとえば、レチクル付きの接眼レンズを使用します。オルガノイドの大部分は、同様のサイズ(約100±20μm)です。他のオルガノイドよりも約2倍小さいか大きいオルガノイドを取り除きました。
8. 培地の半分 (~15 mL) (チルト法を使用) を 1 日おきに NIM と交換します。
9. 培養で3週間後、必要に応じて100xペニシリン/ストレプトマイシンを培地(NIM:DMEM/F12、1x N2サプリメント、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mLヘパリン)に最終濃度1倍で加えます。メディアは一日おきに更新してください。
   手記： このようにして、オルガノイドを最大6ヶ月間培養しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27	Gibco、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	17504-044
bFGFの	Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	PHG0263
BSAの	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	A9647
ディスパーズ	STEMCELL Technologies、バンクーバー、カナダ	7913
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	11330-032
DPBSの	Gibco、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	10010023
成長因子還元マトリゲル(マトリックス)	コーニング、コーニング、ニューヨーク、アメリカ	356231
H9 hESCシリーズ	WiCell、マディソン、ウィスコンシン州、米国	WA09
ヘパリン	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	9041-08-01
L-グルタミン	Gibco、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	〒25030-081
モノチオグリセロール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	M6145
mTESR メディア	STEMCELL Technologies、バンクーバー、カナダ	85850
N2ニューロプレックス	ジェミニバイオプロダクツ、ウェストサクラメント、カリフォルニア州、米国	400から163
NEAAの	Gibco、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	11140-050
トリトンX-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	T8787-100ミリリットル
超低アタッチメントT75フラスコ	コーニング、コーニング、ニューヨーク、アメリカ	3814

サプリメント の 名 名