マウス胚からの眼球運動ニューロン、Trochlearニューロン、および脊髄運動ニューロンの分離と培養

要約

Fujiki, R., et al. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Isl^mn:GFP transgenic mice. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、トランスジェニックマウス胚からの眼球運動ニューロン、滑車ニューロン、脊髄運動ニューロンの分離を示しています。胚は、視覚化と同定を容易にするために、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識された運動ニューロンを発現します。運動ニューロンは、蛍光顕微鏡下で外科的に単離され、培地で維持されます。

プロトコル

1. 腹側中脳・脊髄解剖

>注:ステップ1.1.1-1.1.3および1.1.5-1.1.6を除くすべてのステップを蛍光解剖実体顕微鏡で実行します。実験ごとの総解剖時間は、解剖技術の習熟度と各実験に必要な運動ニューロンの数に応じて、通常3〜5時間です。

1. 腹側中脳解離
   1. 妊娠したマウスを受精後約11.5日で二酸化炭素ガスと子宮頸部脱臼で安楽死させます。
   2. 腹部にエタノールを十分に噴霧し、滅菌マイクロ解剖はさみと親指ドレッシング鉗子を使用して子宮を摘出します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で子宮を短時間洗浄し、次に予冷滅菌PBSで満たされた解剖プレートに移します。
   3. 顕微鏡の明るい光の下で、無菌のマイクロ解剖ハサミ、親指ドレッシング鉗子、およびDumont #5ピンセットを使用して、Isl^MN:GFP(膵島運動ニューロン:緑色蛍光タンパク質)陽性胚を子宮から慎重に取り出します。滅菌済みのMoriaミニ穴あきスプーンを使用して、各胚を、1x B27を補充した予冷済みHibernate-E低蛍光培地で満たされた24ウェルプレートの別々のウェルに移します。24ウェルプレートを氷の上に保ちます。
   4. 1つの胚を滅菌解剖プレートに移し、氷冷した滅菌ハンク平衡塩溶液(HBSS)で完全に覆います。
   5. 解剖ステップが顕微鏡のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)照明下で実行されることを確認してください。ピンセットを使用して、中脳に損傷を与えることなく、胚の尾と顔を取り除きます(図1Ba)。胚をうつ伏せにして置き、手足を下にまたがり、尾を顕微鏡の正面、ディセクタに向けています(アスタリスクで示されています、図1Bb)。
   6. ピンセットを使用して、小さな開口部を生成するために、第4脳室の屋根をスリットで開きます。この開口部を使用して、第4脳室とその屋根の間に作られたスペースにピンセットを引っ掛けます。胚吻側の背側表面に沿って皮質まで、および床板と運動柱の外側を解剖します(図1Ca、b)。解剖した組織をオープンブック方式で開くと、GFP陽性の眼球運動ニューロン(脳神経3[CN3])と滑車ニューロン(脳神経4[CN4])の核が明らかになります
      注:間葉、CN3、およびCN4を含む腹側中脳からの組織の小片が露出します。
   7. 腹側中脳を胚から慎重に分離し、ピンセットとマイクロ解剖ナイフを使用して髄膜組織を切除します。ピンセットとマイクロ解剖ナイフを使用して、両側のGFP陽性CN3およびCN4核を床板およびその他のGFP陰性周囲の組織から離剖します(図1D)。切除した組織内のGFP陽性運動ニューロンの数を最大化しますが、それらに触れたり損傷したりしないでください。
   8. 別々のCN3核とCN4核の集合体が必要な場合は、これら2つの核の正中線に沿って切断します(図1Dの黄色の点線)。P1000ピペットを使用して、解剖した腹側中脳組織を最小限のHBSSで収集し、解剖培地で満たされた標識された1.7mL微量遠心チューブに入れます。解離するまで氷上で保管してください。
   9. 同じチューブ内の追加の胚から腹側中脳をプールし続け、総数が実験要件を満たすまで(理想的な細胞数についてはステップ4を参照)
      注:組織は解離および選別中にストレスを受けるため、約1 x 10⁴ CN3 / CN4運動ニューロンを生成する少なくとも10の腹側中脳のプールされたコレクションが推奨されます。
2. 腹側脊髄解離術
   1. 頭部を顕微鏡の正面に向けて、解剖器に向けて胚をうつ伏せに保ちます。1組のピンセットで胚を保持し、もう一方のピンセットの先端を第4脳室の未開封の尾側部分に挿入します。
   2. 胚の吻尾側全体にわたって、後脳と脊髄の残りの部分を背側に開きます。第4脳室から始まり、鉗子をハサミとして使用して尾側脊髄の中央管に向かって、背側組織を切断して開きます(図1Ca、b)。この手順の間、腹側脊髄に触れたり損傷したりしないように注意してください。
   3. 胚を1組のピンセットで保持し、もう一方のピンセットで両側の背側組織のフラップをつまむ(図1Ea、b).
      注:切除された背側組織には、背側皮膚、間葉、後根神経節(DRG)、背側後脳、および脊髄が含まれます。これらの組織は接着性であり、ろ過中にSMNをトラップしたり、蛍光活性化セルソーティング(FACS)中に目詰まりを引き起こしたりする可能性があるため、脊髄運動ニューロン(SMN)核を損傷することなく、これらの組織をできるだけ多く除去します。
   4. マイクロダイセクションナイフを使用して腹側脊髄を切除し、GFP陽性SMNの真下に穴を開けます。両側をのこぎりのような動きで腹側脊髄を持ち上げます(図1Fa、b)。浮遊する腹側脊髄をC1の真上で横方向に切断し、最初のGFP陽性の前角が突出します(図1G)。また、下肢の上部境界を横方向に切ります(図1G)。この手順の後、腹側脊髄の頸椎(C1)-腰椎(L2-L3)部分を切除します。
   5. 腹側脊髄の背側を上にして置き、GFP陰性組織をGFP陽性SMNカラムの間に1組のピンセットで押し付けて保持します。GFP陽性SMNカラムの両側をマイクロダイセクションナイフでトリミングすることにより、残りの付着した間葉、DRG、および背側脊髄を切除します(図1H)。GFP陽性運動ニューロンを傷つけずに最大限に活用するように注意してください。
   6. P1000ピペットを使用して、解剖した腹側脊髄組織を最小限のHBSSで収集し、解剖培地で満たされたSMN標識1.7mL微量遠心チューブに入れます。解離するまで氷上で保管してください。同じチューブ内の追加の胚からの腹側脊髄を、総数が実験要件を満たすまでプールし続けます。
      手記： 組織は解離および選別中にストレスを受けるため、約2.1 x 10⁴ SMNを生成する少なくとも3つの腹側脊髄を収集することをお勧めします。
   7. Isl^MN:GFPマウス胚の顔面運動ニューロンと四肢を、それぞれ蛍光活性化細胞選別(FACS)のGFP陽性およびGFP陰性のコントロールとして収集します。四肢がGFP陰性であるのは、SMNのGFP陽性軸索がこの胚の年齢ではまだ四肢に伸びていないためです。

2. 組織の解離

>注:総解離時間は通常、実験ごとに1.5時間です。

1. 温かいパパインとアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液は、解離の30分前に37°Cまでアリコートします。.
2. 微小解剖した組織を低速で短時間スピンダウンします。
3. P100ピペットを使用して、組織を吸引せずにできるだけ多くのHibernate Eを慎重に除去します
   注:次のステップでパパイン解離の有効性を低下させないように、このステップの後、必ずすべての残留ハイバネートEを削除してください。.
4. 微小解剖した組織サンプルが入った1.7 mLの微量遠心チューブのそれぞれに、適切な量のパパイン溶液(表1)を加えます
   注:細胞へのストレスを最小限に抑えながら効果的な解離を最大化するために、解離に適したパパインの量を決定しました。
5. P200ピペットで8回静かに三角回転させます。運動ニューロンの生存率を維持するために、すべてのトリチュレーションステップを穏やかに実行します。
6. 組織を含むチューブを37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに指で10回攪拌して攪拌し、インキュベーション後、各懸濁液をP200ピペットで8回静かに滴下します。細胞を300 x gで5分間スピンダウンします。
7. 次のステップでオボムコイド阻害の有効性を確保するには、P1000ピペットを使用して、組織を吸引せずにできるだけ多くの上清を除去および廃棄します。
8. ペレットを適切な量のアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液(表1)に再懸濁し、P200ピペットで8回穏やかに粉砕します。
9. 2分間待って、残りの未解離組織の断片がチューブの底に沈殿するのを待ちます。
10. P200ピペットを使用して、未解離組織を吸引せずに、できるだけ多くの上清を収集します。上清を新鮮な1.7 mL微量遠心チューブに移します。
11. ステップ2.10後も組織の一部のチャンクが未解離のままである場合は、元の1.7 mL微量遠心チューブに残っている未解離組織に対してステップ2.8−2.10を繰り返して、ステップ2.10の上清に含まれる以前に解離した細胞へのストレスを最小限に抑えながら、解離した細胞の最終収量を最大化します。
12. 細胞を300 x gで5分間スピンダウンし、P1000ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。
13. P1000ピペットを使用して8回ピペッティングすることにより、ペレットを適切な量の解剖培地(表1)に再懸濁します。最終懸濁液の適切な量は、細胞密度が10⁷細胞/mLを超えないように決定されました。これによりフローサイトメトリー装置の流れが妨げられる可能性がありますが、細胞が過度に希釈されてソーティング速度が遅くならないようにします。
14. 懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーでろ過し、大きな塊や未消化組織を除去します。懸濁液を5mLの丸底ポリスチレン試験管に移し、必要になるまで氷上に保存します。

>3. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)

>注:このプロトコルは、15 mw 405 nmの紫色レーザー、100 mw 488 nmの青色レーザー、75 mw 594 nmのオレンジ色のレーザー、および40 mw 640 nmの赤色レーザーを装備したFACSソーターを使用して最適化されました。細胞は、無菌PBS中のシース液として、100 μmのノズルを介して無菌条件下で選別しました。細胞ストレスを最小化するために、流速を1-3のサンプル圧力に設定し、毎秒最大1,000-4,000イベントが取得されるようにしました。FACSの合計時間は、通常、実験ごとに1〜2時間です。

1. 順方向散乱と側方散乱の電圧を設定して、細胞集団を適切に視覚化できるようにします。セルソーティングに適切な電圧を設定するのは複雑で、経験豊富なFACSオペレーターが必要です。
2. 異なる細胞集団を区別するには、前方散乱領域(FSC-A)によって決定されるサイズと、側方散乱領域(SSC-A)によって決定される内部複雑性に基づいて細胞をプロットします。図 2Aa および 図 Ba に示すように、生細胞の周囲にゲートを描画して、破片や死細胞を除外します。ゲート領域内の細胞を母集団 1 (P1) としてグループ化します。
3. 細胞の凝集子とダブレットを除外するには、次に、側方散乱幅(SSC-W)とSSC-Aに基づいてP1細胞をプロットします。単一セルの集団を集団 2 (P2) としてゲートします (図 2Ab および 図 Bb)。
4. 前方散乱幅(FSC-W)とFSC-Aに基づいてP2セルをプロットし、単一セルの集団を集団3(P3)としてゲートします(図2Acおよび図Bc)
   手記：3.3 と 3.4 で 2 つの連続したゲートを使用すると、細胞の凝集とダブレット (高 FSC-W および高 FSC-A) は除外されます。
5. GFPとアロフィコシアニン(APC)に基づくP3細胞のゲート。APCチャンネルは自家蛍光を検出します。このチャンネルでのゲーティングにより、自己蛍光細胞の捕捉を回避できます。GFPネガティブセルを使用して、FITC/GFP蛍光チャンネルの電圧を調整します。理想的には、これらの細胞集団のゲートを約10:²に配置します。GFP陽性集団4(P4)のゲート閾値を、運動ニューロンのタイプごとに個別に選択します(図2Adおよび図Bd).
   注:純粋な培養を得るためには、SMNのGFPゲートをCN3/CN4よりもはるかに高く設定します(図2Adおよび図Bd)。SMN培養のGFPゲートが低いと、グリアおよび非運動ニューロンによる培養物の汚染につながります。これは、リーキープロモーターにより、一部のグリアニューロンや非運動ニューロンで低レベルのGFP発現があるためであると考えられます。全細胞と比較したGFP陽性細胞の割合は、CN3/CN4で0.5-1.5%、SMNで1.5-2.5%であるのが普通です。解剖が成功した場合、これらの数値をベンチマークとして使用して、GFP陽性ゲートの適切な位置を決定できます(図2Aeおよび図Be)。
6. メーカーのプロトコルに従ってFACSを実行します。P4細胞を、500 μLの運動ニューロン培養培地で満たされた新鮮な1.7 mL微量遠心チューブに集めます。メッキまで氷上で保管.
   手記： 細胞を直接ウェルに選別することもできますが、その結果、ウェルあたりの細胞数が不均一になります。細胞を1.75 mLの微量遠心チューブに選別し、手動でプレート化して、より均一なプレーティング分布を実現します。

4. 精製された初代運動ニューロンの培養

1. FACSで単離したCN3/CN4およびSMN懸濁液を、それぞれ5 x 10³および1 x 10⁴細胞/mLの密度で37°Cに予熱した運動ニューロン培養培地で希釈します
   手記： 1つのE11.5胚は、約1 x 10³ CN3 / CN4および7 x 10³ SMNを産出します。しかし、これらの収量は、解剖された組織の純度、細胞解離の徹底性、およびFACS中のGFPゲートの適切な閾値化に大きく依存します。
2. ポリD-リジン(PDL)とラミニンでプレコートされた96ウェルプレートを37°C組織培養インキュベーターから層流フードに移し、各ウェルからラミニンを吸引します。プレートとカバーガラスは洗わずにすぐに使用してください。
3. 希釈したCN3/CN4およびSMN懸濁液200 μLをPDL/ラミニンコーティングされた96ウェルプレートの各ウェルに加えます。最終的な細胞密度は、CN3/CN4 および SMN でそれぞれ 1 x 10³ および 2 x 10³ cells/well である必要があります
   手記： 96ウェルプレート(2 x 10³細胞/ウェル)中のSMNの初期めっき密度は、CN3/CN4(1 x 10³細胞/ウェル)の2倍であり、in vitro(DIV)の2日および9日で同様の最終運動ニューロン数と密度を得ることができます(ウェルあたり4-6 x 10²および2-4 x 10²細胞、 それぞれ)。
4. 37°C、5%_CO2インキュベーターでニューロンを培養します。
5. 古い培地の半分(100μL)を取り除き、同量の新鮮な運動ニューロン培養培地と交換することにより、5日ごとにニューロンに栄養を与えます。ニューロンのプロセスが1 DIVで見えるようになり、14 DIVまでに厚く、より長くなることを確認します(図3)。ニューロン細胞体は、特にSMNの場合、長期培養で肥大し、凝集する傾向があります(図3)
   注:培養細胞の剥離を避けるために、元の培地容量の半分を残して、すべての培地および溶液の変更を行います。これには、固定および免疫細胞化学(ICC)ステップが含まれます。すべての培地を取り除いてしまうと、どんなに優しく取り除いても、ほとんどの細胞が剥がれて洗い流されてしまいます。

結果

表 1: 解離ステップで使用されるパパイン、アルブミン-オボムコイド、および最終懸濁液の適切な量。さまざまな数の腹側中脳および腹側脊髄組織で使用するパパインとアルブミン-オボムコイドの適切な量は、数回の最適化の後、製造元の指示から変更されました。組織は解離および選別中にストレスを受けるため、10個を超える腹側中脳と3個を超える腹側脊髄のプールコレクションが推奨されます。パパインの量は、効果的な解離とこの手順のストレスとのバランスを考慮して決定されました。アルブミン-オボムコイド阻害剤溶液の量は、パパインの半分です。Hibernate E最終懸濁液の適切な量は、細胞密度が10⁷細胞/mLを超えないように決定しましたが、細胞が過度に希釈されませんでした。

中脳の数(X)

パパイン

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント(50X)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504-044
BD FACSAria llu SORP フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	-	これには、405、488、594、および640nmのレーザーを備えた4つのレーザーシステムがあります。
BD Falcon 70μm ナイロンセルストレーナー	コーニング	352350	FACSの前の解離セルをフィルタリングするため。
BDファルコン丸底試験管(スナップキャップ付き	コーニング	352054
BDNFヒューマン	ProSpec-Tany テクノジーン(株)	CYT-207
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、F底(チムニーウェル)	グライナーバイオワンインターナショナル	655090	私たちは複数の96ウェルディッシュを試しましたが、これはICC後の培養と分析に最適なものでした
CNTFヒューマン	ProSpec-Tany テクノジーン(株)	CYT-272
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルイノドール(DAPI)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	D2650	DMSOの
デュモン#5鉗子イノックスチップサイズ.05 x .01 mmバイオロジーチップ	Roboz手術器具	RS-5015
フォルスコリン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP25205
GDNFヒューマン	ProSpec-Tany テクノジーン(株)	CYT-305
GlutaMAXサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050-061
ハンクスバランス塩溶液(HBSS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14175-095
ハイバネートE	ブレインビッツ	彼
Hibernate E低蛍光	ブレインビッツ	シェルフ	胚のGFP発現の観察を妨げる蛍光は低くなければなりません。
馬用美容液、熱不活化、ニュージーランド産	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26050-070
IBMXの	トクリス・クックソン	2845	イソブチルメチルキサンチン
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017-015
リーボビッツのL15ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11415064
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M6250
マイクロ解剖ハサミ	Roboz手術器具	RS-5913
マイクロナイフ 4.75インチ 1.7 x 27 mm ブレード	Roboz手術器具	RS-6272
モリアミニ穴あきスプーン	ファインサイエンスツール	10370-19
オリンパス 1.7ml マイクロチューブ クリア	ジェネシー・サイエンティフィック	22から281	これらは、文脈で「1.7mL微量遠心チューブ」と説明したチューブです。
パパイン解離システム	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LK003150	パパイン溶液とアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液は、このキットから調製されます。
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023
ポリD-リジン(PDL)	ミリポアシグマ	A-003-E
SMZ18およびSMZ1500ズーム実体顕微鏡(DS-Ri1カメラ付き	ニコン	-	解剖を行い、解剖した胚および組織の画像をこれらの蛍光顕微鏡で撮影しました。
Sylgard 170 ブラック シリコン カプセル化剤 - A+B 0.9 Kg キット	ダウコーニング	1696157	このキットを使って解剖皿を作っています。
TC処理ディッシュ、100 x 20 mm	ジェネシー・サイエンティフィック	25〜202	この皿を使って解剖皿を作ります。
Thum ドレッシング鉗子 4.5" 鋸歯状 2.2 mm 先端幅	Roboz手術器具	RS-8100
Zeiss LSM 700シリーズレーザー走査型共焦点顕微鏡とZenソフトウェア	カールツァイス	-	これらの装置で胚の共焦点画像を撮影しました

) の 名 )