細胞生産施設での神経幹細胞培養の取り扱い

要約

出典:Stover, A. E., et al,.基礎研究および前臨床研究のための密閉型細胞培養システムでのヒト多能性幹細胞および神経幹細胞の培養。J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオでは、ニューロン幹細胞の成長と維持のために、細胞培養ワークステーションで制御された環境を維持する手順を概説しています。これらの手順には、チャンバー条件の設定、洗浄プロトコル、および培地調製が含まれるため、最大限の無菌性と再現性を維持し、従来の方法に取って代わることができます。

プロトコル

1. 初期設定

1. ガスと温度の濃度の設定
   1. ソフトウェアを使用して、グラフィカルインターフェイスの左上隅にある[ゲスト]タブをクリックします。指定されたユーザ名とパスワードを使用してシステムにログインします。各ユーザーがユーザー名とパスワードを持っていることを確認してください。
   2. 調整するモジュールをクリックします(図1)。現在の設定を表示する新しいウィンドウで、「セットポイント」の下にある既存のO₂セットポイント値をクリックし、このモジュールに必要な_O2濃度レベルを入力します。このモジュールで多能性幹細胞を増殖または操作する場合は5% O₂を、神経幹細胞を増殖または操作する場合は9% O₂を入力します。緑色のチェックマークをクリックして、設定ポイントを確認します。
      手記：層流フードと顕微鏡チャンバーの2つのモジュールはガス調整できません。層流フード内のガス濃度は大気圧ですが、プロセスチャンバー内のガス濃度は顕微鏡チャンバー内のガス濃度を受動的に維持します。
   3. CO₂ に対してこの手順を繰り返します。O₂のみを調整するバッファーチャンバーを除くすべてのモジュールに5%CO₂の設定値を入力します。
   4. 「プロセス値」とラベル付けされた現在のガス濃度を監視して、新しい設定値に達することを確認します。
   5. すべてのモジュールのガス設定値を適切な値に調整します。互いに曝露されるチャンバーの_CO2レベルと_O2レベルを一致させます。例えば、5% O₂で細胞を増殖させるインキュベーターを開く前に、プロセスチャンバーを5% O₂に調整します。また、この間にプロセスチャンバーにアイテムを追加するために使用される任意のバッファーチャンバーで5%O₂に変更します。
   6. ガス調整用の同じ画面を使用して、プロセスチャンバーの温度を37°Cに設定します。また、プロセスチャンバーの床温度は37°Cに設定する必要があります。
   7. 各インキュベーターの下にあるインキュベーションモジュールバンクをクリックします。バンクの温度を37°Cに調整します。
2. バッファーチャンバーの操作
   1. ワークフローの遅延を防ぐために、最初に特定のタスク(摂食、分割、染色など)に必要なすべての消耗品を収集します。すべての材料に70%エタノールをたっぷりとスプレーし、層流フードで乾燥させます。フラスコや細胞のプレートにスプレーしないでください—70%エタノールで飽和した滅菌ガーゼスポンジでそれらを優しく拭いてください。
   2. バッファーチャンバーの外側と内側のドアがしっかりと閉まっていることを確認します。次に、外側のドアを開けて、アイテムを中に入れます。
   3. 外側のドアを閉じます。ソフトウェア内でバッファーモジュールを選択し、希釈係数タブをクリックします。ログ係数ボックスに 1 つ入力します。start.
      をクリックします。 注:「希釈係数」とは、バッファーモジュールの雰囲気を排気し、HEPAでろ過されたクリーンなガスと一度交換することを意味します。
   4. グラフィカルインターフェースが「希釈係数」の点滅を止めたら、バッファーチャンバーの内側のドアを開き、材料をプロセスチャンバー内に入れます。
      注意:内側と外側のドアを同時に開かないようにしたり、バッファーチャンバーに希釈係数がかかっていない場合は内側のドアを開けたりしないでください。
   5. まず、プロセスチャンバーからアイテムを取り出し、バッファーチャンバーに希釈係数が適用されていることを確認します。次に、内側のドアを開けて、取り外すアイテムを内側に置き、内側のドアを閉めます。次に、外側のドアを開けてアイテムを取り除きます
      注意: 外側のドアを開く前に希釈係数を実行してはなりません。

2. 細胞の導入と摂食

1. インキュベーターのセットアップ
   1. 各インキュベーターの底にあるウォーターパンに3つのシャーレを置きます。これらの皿には、鍋を直接充填するのではなく、滅菌水を入れます。これらのディッシュは、インキュベーターの相対湿度(RH)設定値を維持するために重要であるため、水位を維持してください。
   2. グラフィカルインターフェース内で、インキュベーターをクリックします。設定値の下で、既存の相対湿度(RH)値をクリックし、85%と入力します。緑色のチェックマークをクリックして、この値を受け入れます。
2. 細胞用細胞生産設備の整備
   1. まだ調整していない場合は、バッファーチャンバー、プロセスチャンバー、およびインキュベーターを、導入する細胞のタイプに必要なガス設定値に調整します。
   2. プロセスチャンバーの表面を滅菌ガーゼと不燃性の消毒剤で洗浄します。過酢酸ベースの消毒剤は使用しないでください。閉鎖系では、強くて残留する蒸気は哺乳類細胞に対して有毒です。代わりに、塩化ベンザルコニウムベースの製品を使用してください。
   3. 消毒を続けます。手袋やドアハンドルなど、よく触れる表面を清掃します。消毒剤は、プロセスチャンバー内の過剰な液体が湿度、結露、および微生物の増殖に寄与するため、徹底して使用してください。
   4. 層流フードとバッファーチャンバーの表面を70%エタノールで洗浄し、乾燥させます。フードに細胞(この場合はPSC(多能性幹細胞)またはNSC(神経幹細胞))のフラスコまたはプレートを置き、エタノールを飽和させた滅菌ガーゼスポンジで外面を軽く拭きます。
   5. フラスコまたはプレートをバッファーチャンバーに入れ、希釈係数を実行します(ステップ1.2.3)。
   6. 希釈係数が完了したら、すぐにフラスコまたはプレートを適切なインキュベーターに移動します。インキュベーターはプロセスチャンバーの後ろにあるため、シェルフをプロセスチャンバーに引き出して細胞を配置します。インキュベーターのドアを不必要に開けたり、長時間開けたりすることは避けてください。なぜなら、プロセスチャンバーの空気はインキュベーターの空気に比べて非常に乾燥しており、インキュベーター内の湿度が大幅に失われるからです。
3. 細胞培養物の供給
   1. 血清ピペット、電動ピペット、ガーゼ、消毒剤などの培地部品を集めます。また、使用済み細胞培養培地用の廃容器を集めますが、漂白剤は充填しないでください。セクション1.2で説明されているように、バッファーチャンバーを介して材料をプロセスチャンバーに持ち込みます。最適な作業スペースができるように材料を配置します。プロセスチャンバーの中央に使用しないものを置かないでください。
   2. 培地容器を少しキャップを外して、培地がシステム内に存在する_CO2およびO₂レベルと平衡化できるようにします。一部のPSC媒体メーカーは、37°Cで媒体を温めないことを示しています。その場合は、バッファーチャンバーを使用して培地を平衡化します。培地を20分間平衡化させます。
   3. 適切な立体ピペットと電動ピペッターを使用して、古い培地をウェルから取り出します。PSCの場合は、供給プロセス中の乾燥を防ぐために、残っている古い培地を少量を除いてすべて取り除きます。NSC の場合は、古いメディアの半分を削除します。廃棄物を廃棄物容器にピペットで入れます。
   4. 使用済みのピペットを元のラッパーに戻し、プロセスチャンバーの側面または廃棄物除去用に指定されたバッファーチャンバーに移動します。新鮮な滅菌血清学的ピペットを使用して、新鮮な培地を細胞培養プレートに加え、プレートを指定されたインキュベーターに戻します。
   5. 給餌終了時には、ガーゼに消毒剤をスプレーし、プロセスチャンバーの床とドアハンドルを徹底的に清掃します。システム内で複数の細胞株を増殖させている場合は、各細胞株の給餌の合間に滅菌します。これにより、クロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えることができます。
   6. 完了したら、バッファーチャンバーの1つから廃棄物やその他の不要なアイテムを取り除きます。

>3. 細胞培養の分裂

1. PSCまたはNSCの酵素継代
   1. 通過に必要なアイテムをすべて集めます。これには、培地、酵素または非酵素細胞解離バッファー(後者はNSC専用)、DPBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)、プレートまたはフラスコ、細胞外マトリックス(ECM)、コニカルチューブ、および血清ピペットが含まれます。バッファーチャンバーを使用してシステムに取り込んでください。
   2. 前述した9,10のように、新しい皿またはフラスコをECMでコーティングします。マウス肉腫細胞株に由来するECMなど、一部のECMは4〜15°Cの液体しかないため、滅菌したコールドブロックまたはゲルアイスパックを使用して、加熱されたプロセスチャンバーでの作業中はECMを冷たく保
   ちます。
   3. 培養物から使用済み培地をピペットで取り出し、廃棄物容器に廃棄します。
   4. 1 mlのDPBS /ウェルを使用してウェルまたはフラスコの表面をすすぎ、DPBSを廃棄します。
   5. 各ウェルに1〜2mlの温かい酵素を加えます。非常に密度の高い培養物のみ2mlが必要です。
   6. すぐに培養皿またはフラスコを顕微鏡チャンバーに移動し、培養を観察します。個々の細胞が皿から緩み始める兆候に注意してください。セルが浮遊して懸濁状態になるまで待たずに、次のステップに進みます。
   7. 細胞をメインプロセスチャンバーに戻します。5 mLの血清ピペットを使用して、酵素1 mLごとに4 mLのDPBSを添加し、その後、ピペッティングを強力に上下させて細胞をウェル表面から取り除きます。マルチウォールプレート内で複数のウェルを継代する場合は、個々のウェルから細胞を取り除く前に、各ウェルにDPBSを追加します。
   8. 酵素とPBS細胞懸濁液を適切なサイズの円錐形チューブに移します。
   9. セル製造施設に遠心分離機が利用できない場合は、円錐管をしっかりと密封し、緩衝チャンバーに入れ、ドアを閉めて密閉します。
   10. 円錐管を層流側からバッファーチャンバーから取り外し、細胞を100 x gでRTで5分間回転させます。
   11. コニカルチューブに70%エタノールを噴霧し、緩衝チャンバーと希釈係数を使用してプロセスチャンバーに持ち込みます。
   12. 上清をピペットで取り除き、細胞を2 mLのPSCまたはNSC培地に再懸濁します。PSCを継代する場合は、ROCK(Rho関連プロテインキナーゼ)阻害剤を10 μMの濃度で培地に含めてください。
   13. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、必要なウェルまたはプレートを決定します。PSCを5 x 10⁴ - 1 x 10⁵細胞/cm²でプレート化します。NSCを1:2の比率で分割します。
       注:NSCは、血球計算盤で凝集して正確な計数に抵抗することがよくあります。
   14. 細胞の凍結保存が必要な場合は、すべての供給品と凍結培地が調製され、プロセスチャンバー内に配置されていることを確認してください。DMSO(ジメチルスルホキシド)は37°Cで細胞に非常に毒性があるため、迅速に作用します。イソプロパノールジャケット付き冷凍容器をRTで層流フードに保管します。凍結保存バイアルを充填して密封したら、すぐにバッファーチャンバーに通してプロセスチャンバーから取り出します。
2. PSCの手動通過
   1. 前に説明したように、カルチャを渡す必要があることを確認します。その場合は、細胞外マトリックスでコーティングされた新しいプレートまたはフラスコを準備します。次に、メディアを完全に変更します。
   2. 顕微鏡チャンバーは、不燃性の消毒剤を少量含ませた滅菌ガーゼで洗浄します(多すぎると過剰な曇りが発生します)。手袋、床面、ステージのみを清掃してください。200 μlまたは1,000 μlの個別包装されたピペットチップを数個チャンバーに持ち込みます。
   3. PSCのプレートを顕微鏡チャンバーに持ち込み、蓋を取り外し、清掃したばかりの床に伏せて置きます。蓋を開けたままにしておくと、下側が気流に直接さらされ、汚染される可能性があります。
   4. ピペットチップを開封し、顕微鏡で培養物を可視化し、ピペットの先端で形態の良いコロニーをバラバラにします
      注:ピペットチップは、個々のユーザーがピペットに取り付けた方が快適だと感じる場合に取り付けることができます。
   5. プレートの蓋を元に戻し、プレートをプロセスチャンバーに戻します。
   6. 新しいプレートから余分なECMをピペットで取り除き、古いプレート(懸濁液中のコロニー片を含む)から新しいプレートに培地を移します。古いプレートにまだピッキングの準備ができていないコロニーが含まれている場合は、それらも給餌します。

結果

図 1.セル生産施設のグラフィカルインターフェース。(A)CPFのグラフィック表現はデフォルトの画面であり、図3に示すCAD図面と一致します。Buffer Module 1 をマウスでクリックすると、制御画面 (B) が開き、O₂ 値が処理チャンバーと一致するように設定されます。同様に、Process ChamberまたはIncubator 1をクリックすると、それぞれの制御画面(それぞれCおよびD)が表示され、必要に応じて値を変更または監視することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Xvivoシステム	バイオスフェリックス	カスタムメイド
Xvivoソフトウェア	バイオスフェリックス	バージョン I.O.2.1.2.1
O2マニホールド	アミコ	P-M2H-C3-S-U-オキシ
CO2マニホールド	アミコ	M2H-C3-D-U-CO2
N2マニホールド	ウエスタン・イノベーター	CTM75-7-2-2-BM
O2ガス
CO2ガス
N2ガス
ペトリ皿
水
滅菌ガーゼ
70%エタノール	BDHの	BDH1164-4LP
塩化ベンザルコニウムベースの消毒剤
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水
Hank'sベースの細胞解離バッファー	ライフテクノロジー	13150-016
2mL セロロジカルピペット	VWRの	89130-894
5mL セロロジカルピペット	オリンパスのプラスチック	12から102
10mL セロロジカルピペット	オリンパスのプラスチック	12〜104
25mL セロロジカルピペット	オリンパスのプラスチック	12〜106
50mL セロロジカルピペット	オリンパスのプラスチック	12〜107
6ウェルプレート	コーニング	353046
20uLピペットチップ	エッペンドルフ	22491130
200uLピペットチップ	エッペンドルフ	22491148
1000ピペットチップ	エッペンドルフ	22491156
DP21カメラと蛍光顕微鏡	オリンパス株式会社	CKX41
リン酸緩衝ナトリウム	ハイクロン	9236
ジメチルスルホキシド	プロタイド	PP1130
手袋

の 名