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ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)系統HPS1006は、文部科学省/AMEDのバイオリソースプロジェクトを通じて理研BRCから提供されました。
1. 内皮前駆細胞(EPC)へのhiPSC分化誘導
- 細胞外マトリックス(ECM)コーティングプレートおよび試薬
- 基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルプレートを、2.5 mgのマトリックスゲルを50 mLの遠心チューブに分注して調製し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。冷蔵庫(4°C)で保存した冷たいダルベッコ改質イーグルの培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)を30mLチューブに加えます。ゲルが融解するまでピペッティングで穏やかに混合し、12ウェルプレートの各ウェルに500μLの溶液を加えます。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に少なくとも1時間置く
手記：基底膜マトリックスゲルは温度に敏感であり、分注およびプレートコーティングに関する製造元の指示に従って取り扱う必要があります。細胞外マトリックスタンパク質の濃度は、バッチ間で異なる場合があります。精度を確保するために、正確な濃度は、ロット番号を使用して、特定のバッチの品質証明書シートで参照する必要があります。例えば、正確な濃度が10.0 mg/mLの場合、250 μLのゲルを使用して合計2.5 mgにします。
- rho-キナーゼ(ROCK)阻害剤ストック溶液を滅菌水に10 mMの濃度に溶解して調製します(表1)。ストック溶液を100〜200 μLの容量で分注し、凍結融解サイクルを避けるために-20°Cで保存します。
- 5 gのL-アスコルビン酸を50 mLの滅菌水に溶解して、L-アスコルビン酸100 mg/mLの原液を調製し、-20°Cで保存します(表1)。6.25 mLのグルタミンと305 μLのL-アスコルビン酸ストック溶液を500 mLの高度なDMEM/F12に加えて、LaSR培地を調製します(表1)。2〜8°Cで最大2週間保管してください。
溶液- CHIR99021、CHIR99021を原液のジメチルスルホキシド(DMSO)に最終濃度10 mMまで溶解して調製します(表1)。凍結融解サイクルを避けるために、溶液を100〜200 μLの容量に分注し、-20°Cで最大1年間保存します。ストック溶液の作業用アリコートは、4°Cで最大1ヶ月間保管してください。
- 450 mLのDMEM/F12に50 mLの熱不活化ウシ胎児血清を加えて、DMEM/F12-10培地を調製します。培地は2〜8°Cで最大1ヶ月間保存してください(表1)。
- 33.3 mL の 7.5% ウシ血清アルブミン(BSA)を 467 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加えて、フローバッファー-1 を調製します(表 1)。2〜8°Cで最大6か月間保管してください。
- 特異化ヒトiPS細胞の播種とEPC分化のための拡大(-3日目から-1日目)
- 6ウェルプレート中のhiPSCコロニーが自発的な分化を示さず、継代に適した密度(通常は約80%のコンフルエント(2.5-3.5 x 106細胞))を持っているときに分化を開始します。顕微鏡下で自然分化細胞を注意深く観察し、未分化細胞を排除するために複数回の継代が必要かどうかを確認します。細胞培養培地および細胞外マトリックスに関する情報については、ステップ1.4.15の注記を参照してください。
- 培地を吸引し、1 mLの解離試薬をウェルに加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。解離試薬溶液をウェルの表面に2〜3回穏やかにピペッティングして、細胞を解離し、単離します。
- 剥離した細胞を4 mLのhiPSC維持培地を含む15 mLチューブに移し、細胞を完全に再懸濁します。細胞カウント用に10 μLのアリコートを予約します。
- 20-25°Cで200 x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞をカウントし、基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルプレートで適切な密度のhiPSC(ウェルあたり75-400 x 103)を達成するために必要な容量を計算します(ステップ1.1.1)。
- ウェルからコーティング溶液を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を含むhiPSC培地1 mLを各ウェルに加えます(1:1,000希釈)。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを1 mLのhiPSC培地で解離します。
- ステップ1.2.4で決定した必要量のhiPSCを、12ウェルプレートの各ウェルに加えます。2〜4枚の12ウェルプレートで、hiPSCクローンの分化には十分です。ステップ1.2.4を参照して、セルの播種に必要なプレートの数を決定します。
- プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。インキュベーター内でプレートを前後に、次に左右にゆっくりとスライドさせることにより、細胞を均等に分配します。
- 翌日(すなわち、-2日目)に、培地をROCK阻害剤を含まない2mLのhiPSC維持培地と交換します。翌日(-1日目)に、培地を2 mLの新鮮なhiPSC維持培地と交換します。
- グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)阻害剤によるEPCの誘導CHIR99021(0日目から5日目)
- 0日目に、各ウェルのhiPSC維持培地を、8μMのCHIR99021を含む2mLのLaSR培地と交換します。
- 1日目に培地を吸引し、8 μMのCHIR99021を含む新鮮なLaSR培地2 mLを加えます。
- 2日目、3日目、4日目に、培地をCHIR99021が不足している新鮮なLaSR培地2mLと交換します。
- CD31+ EPCを精製するための磁気活性化細胞ソーティング(MACS)(5日目)
- 5日目に培地を吸引し、各ウェルに1 mLの解離試薬を加えてから、37°Cで6〜8分間インキュベー
トします。
- マイクロピペットで細胞を解離して単離し、40 μmの細胞ストレーナーを通過して懸濁液をろ過し、10 mLのDMEM/F12-10培地を含む50 mLのチューブに入れます。2つ以上の12ウェルプレートから採取した細胞懸濁液を、少なくとも2本の50 mLチューブにろ過します。
- DMEM/F12-10培地(最大50 mL)を添加して消化反応を停止します。ピペットで十分にピペットを動かし、細胞をカウントするために10 μLを確保します。細胞を200 x g、20-25°Cで5分間遠心分離してペレット
化します。
- 上清を除去した後、10 mLのDMEM/F12-10培地を加え、細胞懸濁液を新しい15 mLチューブに移します。細胞を200 x g、20-25°Cで5分間遠心分離してペレット
化します。
- 上清を吸引し、バッファー100μLあたり1.0×107細胞の密度でフローバッファー-1に再懸濁します。
- Fc受容体(FcR)ブロッキング試薬を1:100の比率で添加し、5分間インキュベートしてから、1:200に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識CD31抗体を添加します。懸濁液を20〜25°Cの暗闇で30分間インキュベートします。
- 10 mLのフローバッファー-1を添加し、懸濁液10 μLをフローサイトメトリー分析用に留保して、CD31+細胞の画分を測定します(図1)。
- 細胞を200 x gで5分間遠心分離し、20〜25°Cでペレット化します。次に、上清を除去し、フローバッファー-1溶液100 μLあたり1.0 x 107細胞の密度に再懸濁します。FITCセレクションカクテル(細胞懸濁液100μLあたり5μL)を加えます。ピペッティングで十分に混合し、暗所で20-25°Cで15分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液100μLあたり5μLの磁性ナノ粒子を添加し、ピペットウェルでピペットで20〜25°Cで10分間暗所でインキュベー
トします。
- 細胞懸濁液を5 mLのフローサイトメトリーチューブに移し、フローバッファー-1を添加して総容量2.5 mLにします。フローサイトメトリーチューブを磁石に5分間入れます。
- 連続的な動きで、磁石を反転させ、FITC-CD31抗体で標識されていない細胞を含む細胞懸濁液をデカントします。磁石とチューブを逆さまの位置に2〜3秒間保持してから、残りの液体を取り除きます。チューブを直立位置に戻す前に、チューブの端に付着した液滴を吸引してください。
- マグネットからフローサイトメトリーチューブを取り出し、2.5 mLのフローバッファー-1を加えて、残りのCD31+細胞を洗浄します。細胞を2、3回ピペッティングして細胞を再懸濁します。フローチューブを磁石に5分間入れます。
- 手順1.4.11〜1.4.12を3回繰り返し、次に手順1.4.11をもう一度繰り返して、合計4回の洗浄を行います。
- フローチューブを磁石から取り外し、指示された量の適切な培地(例:拡張EC培養用のヒト内皮無血清培地[hECSR]または凍結用の凍結培地)をチューブに加えて、精製したCD31+細胞を再懸濁します。懸濁液の2つの10 μLアリコート(1つは細胞カウント用、もう1つはMACS後のサンプル中のCD31+細胞の純度を評価するためのフローサイトメトリー分析用)を予約します(図1)。フローサイトメーターがすぐに利用できない場合は、分析までアリコートを4°Cで保存してください。
- この時点でCD31+ EPCをフリーズします。
手記：ビトロネクチン被覆12ウェルプレートおよびより安定性の高いiPS細胞維持培地(mTeSR plus)は、基底膜マトリックス被覆プレートおよびhiPS細胞維持培地(mTeSR1)の代わりに使用することができます。ビトロネクチンコーティングされた12ウェルプレートを調製するには、ビトロネクチンを希釈バッファーで最終濃度10 μg/mLまで希釈し、希釈した溶液500 μLを12ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを20〜25°Cで少なくとも1時間放置します。特異化したヒトiPS細胞の播種密度は、基底膜マトリックスコーティングプレートに用いられる密度と同等です。培地やマトリックス組成を変更すると、ヒトiPS細胞の増殖や自然分化に影響を与える可能性があり、新しい培養条件に適応するには通常1〜2週間かかります。より安定したhiPSC維持培地をhiPSC維持培地に用いる場合、iPSC維持培地の代わりにこの培地をEPC鑑別に用いることができます。この場合、より安定性の高い iPSC 維持培地を -2 日目に交換して ROCK 阻害剤を除去し、-1 日目の交換をスキップできます。