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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>1. 培地調製と幹細胞回収
- ステップ1.1.1.-1.1.5で試薬を組み合わせて、培地ストック(DFHGPS)を調製します。
- 210 mLのDulbecco's Modified Eagle Mediumを高グルコースとL-グルタミン(D)とともに加えます。.4°Cで保存してください。
- ハムのF12栄養ミックス70mLとL-グルタミンサプリメント(F)を加えます。4°Cで保存してください。
- 15 mM HEPES Buffer (H) 4.2 mL を添加し、室温で保存します。
- 10%D-グルコース溶液(G)4.2mLを加え、室温で保存します。
- 2.88 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(PS)溶液を加えます。.ストック溶液を3mLのアリコートに分注し、必要になるまで-20°Cで保存します
手記：培地中のペニシリンの最終濃度は 100 単位/mL で、ストレプトマイシンの濃度は 100 μg/mL です。この培地は、プロトコルの残りの部分でDFHGPSと呼ばれ、1〜2週間以内に使用するために4°Cで保存する必要があります。必要に応じて、DFHGPS を比例的にスケールアップできます。
- 細胞が回収される前日に、T75フラスコにhNSC細胞株の以前の培養物から得られた5mLの馴化培地をコーティングし、8.5%の二酸化炭素(CO2)を入れた37°Cのインキュベーターに一晩放置します
手記： 現在hNSCを培養している場合は、培地交換中に細胞が増殖していた培地を保存してください。これは、細胞によって「調整」されているため、調整された培地です。馴化培地はスクリューキャップチューブに保存し、4°Cで約7日間保存できます。hNSCを受け取るには、対応する著者に連絡してください。馴化培地が好ましいですが、特にhNSCの培養を初めて開始する際には、絶対に必要というわけではありません。
- 回復の日には、50 mLのスクリューキャップチューブに20 mLのDFHGPSを37°Cのウォーターバスで少なくとも10分間温め、使用する準備ができるまでウォーターバスに保管します。
- 別の15 mLスクリューキャップチューブで、10 mLのDFHGPSを37°Cのウォーターバスで少なくとも10分間温め、ステップ1.13で使用する準備ができるまでウォーターバスに保管します。
- 氷の容器とすべての中程度の成分を取り出します(表1)。氷上のすべての培地成分を解凍し、培地交換の準備をしている間、氷の上に置いておきます。
- 5 mLの馴化培地(4°Cで保存)を取り出し、ステップ1.14で使用する準備ができるまで37°Cのウォーターバスで保管します。ステップ1.2の後の注で、コンディショニング培地または現在のヒト胎児神経幹細胞培養がない場合は、注を参照してください。
- ステップ1.3から50mLスクリューキャップチューブを取り出し、バイオセーフティキャビネット(BSC)に入れます。10 mL の DFHGPS を新しい 15 mL スクリューキャップチューブに移し、残りの 10 mL の DFHGPS 培地が入った 50 mL チューブを 37 °C のウォーターバスに戻します。
- 液体窒素に保存されたhNSCのクライオバイアルを入手します。現在ヒト胎児神経幹細胞培養がない場合は、ステップ1.2の後の注を参照してください。
手記：ヒト神経幹細胞は、もともと廃棄されたヒト胎児の脳12に由来し、遺伝子組み換えなしで培養10で維持されました。5セル×10セル6セルを解凍し、T75フラスコに播種する必要があります。各クライオバイアルには、5個×10個の6個の細胞が含まれている必要があります。したがって、フラスコごとに1つのバイアルが必要です。
- 37°Cのウォーターバスで、バイアルを約10秒ごとに反転させることにより、または氷が溶けてバイアルの内容物が完全に液体になるまで解凍します。潜在的な汚染を避けるために、バイアル全体を水に浸さないでください。
- BSCでは、P1000マイクロピペットを使用して解凍した細胞溶液を吸引し、10 mLのDFHGPSを含むステップ1.7の15 mLチューブに滴下します。解凍したセル溶液を滴下するには、プランジャーをゆっくりと押し下げて、一度に1滴または2滴だけが放出されるようにします。その間、15 mLチューブを渦巻いてすばやく混合します。
- 細胞懸濁液を200 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを確実に保持します。
- ステップ1.11で、ステップ1.7の残りの10mLが入った50mLチューブを取り出します。遠心分離後、細胞ペレットを10 mL DFHGPSに再懸濁し、再び200 x gで室温で5分間遠心分離します。
- 最終スピン中に、表1に従って新しい増殖培地を調製し、BSCのステップ1.4(表1)のDFHGPS培地10 mLに成長因子を添加します。成長因子を含む新しい培地は、使用する準備ができるまでBSCに置いておきます。
- ステップ75からT1.2フラスコを取り出し、フラスコを吸引してコーティングした調整された媒体を廃棄します。次に、ステップ1.6で採取した5 mLのコンディショニング培地を添加します。血清学的ピペットを使用してフラスコに。フラスコの底を引っ掻かないように注意してください。
- 遠心分離機から細胞のチューブを取り出し、上清を吸引して廃棄し、細胞ペレットをそのままにします。
- ステップ 1.13 で開始した 10 mL の新しい培地に細胞ペレットを再懸濁するには、5 mL の血清ピペットを使用し、数回ピペッティングします。ステップ1.14からコーティングされたT75フラスコにサスペンションを追加します。残りの5mLを使用して、細胞ペレットが含まれていたチューブをすすぎ、次にそれらの5mLもフラスコに加えます。
- T75フラスコを前後に3回揺らして、細胞がフラスコ全体に均等に分布していることを確認します。フラスコのキャップが緩んでいて、空気が流れるようにしてください。光学顕微鏡で細胞を観察し、メモを取り、可能であれば画像を撮ります
手記： 細胞は半透明で球形に見えるはずです。暗く見える細胞、不透明に見える細胞、または境界線が非対称な細胞がある場合は、細胞死を示している可能性があるため、メモします。また、メディアの色が黄色くなるなど、真菌や細菌の汚染に注意してください。
- 細胞のフラスコを8.5% CO2.
の入った37°Cインキュベーターに入れます
手記： この無血清培地のpHを7.1〜7.4の範囲で維持するために、5.0%CO2の代わりに8.5%を使用してください。
2. hNSC 中規模変更
>注:3〜4日ごとに媒体を交換してください。
- BSCをオンにし、70%エタノールで完全に洗浄します。光学顕微鏡で細胞を観察します.
手記： セルの外観と球のサイズについてメモします。回復または継代の3日後、細胞は一緒に集まり、非接着性のニューロスフェアを形成し始めます
注意：細胞がフラスコの底に付着すると、細胞の付着により早期の分化が増加し、細胞が幹の状態を維持できなくなるため、培養物を廃棄する必要があります。フラスコ内の細胞が多すぎると、細胞は大きな球体(直径2mm以上)を形成する可能性があり、その場合、球体の中心にある細胞は、培地中の成長因子へのアクセスがないために分化し始めます。直径1mmより大きい球体が観察された場合、細胞を継代することができます(ステップ3.1-3.22)。
- 手順1.4と1.5に従い、10 mLの新鮮な培地を調製します(手順1.13を参照)。
- フラスコを横に傾けて、球体がフラスコの底に沈むようにします。
- 5 mLの血清ピペットを使用して、プールした培地の上部から5 mLのコンディショニング培地を取り出し、ニューロスフェアを吸引しないように注意します。5 mLのコンディショニング培地を清潔な15 mLチューブに入れます。
- フラスコからさらに5 mLのコンディショニング培地を取り出し、再び球体を慎重に避け、5 mLを同じ15 mLチューブに入れます。
- ステップ 2.2 で得られた 10 mL の新しい培地を、フラスコ内の残りの 5 mL のコンディショニング培地および細胞に加えます。フラスコを平らに置き、光学顕微鏡で細胞を観察します。
- 馴化培地の収集中に細胞が吸引されたと思われる場合は、馴化培地を100 x gで室温で5分間回転させます。底部に蓄積した細胞を1 mLの馴染培地に再懸濁し、それらを培養フラスコに加えます。
- ステップ 2.5/2.6 で得られた 10 mL の未使用のコンディショニング培地を 4 °C で 15 mL のスクリューキャップチューブに保管します。
- 手順1.17 / 1.18を繰り返します。
3. hNSCパッセージ
- NSCを新しいフラスコに拡張する場合は、すべての新しいフラスコが手順1.2のようにコーティングされていることを確認してください。
- 手順 2.1 と同様に BSC をクリーニングし、手順 1.4 と 1.5 を実行します。
- 手順1.13のように培地を準備します。各T75フラスコには10 mLの培地が必要です。複数のT75フラスコを使用する場合は、10 mLの培地にフラスコの数を掛けます。
- 1 mLまたは3 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)とグルコースを調製し、37°Cの水浴に入れて、表2の容量に従って10分間温めます(トリプシン溶液の場合)。このとき、トリプシンやDNaseを追加しないでください。DNaseは、機械的または化学的な細胞解離により死細胞から放出されたDNAを分解するために必要になる場合があります.
注:成長の9〜10日後に継代された1つのT75フラスコの場合、5×106が最初にフラスコに播種された場合、約30×106セルが存在することになります。通常、10 × 106細胞に1 mLのdPBS溶液を使用します。したがって、9〜10日後にT75フラスコを継代するには、3mLのdPBS溶液が必要です。
- 清潔な小型の計量ボートと血球計算盤をフードに入れます。70%エタノールで洗浄し、フード内で約5分間><風乾させます。
手記： 計量ボートはステップ3.17.1で使用されます。
- インキュベーターから継代される細胞のフラスコを取り出し、BSCに持ち込みます。フラスコを静かに傾け、細胞がプールされた培地の底に沈むようにします。フラスコには約15mLの培地が入っています。
- 約10 mLの培地を5 mLの部分(つまり、5 mL + 5 mL)で取り出します。この10 mLの培地を、「コンディショニング培地」の「CM」とラベル付けされた清潔な15 mLチューブに入れます。フラスコ内の残りの5 mLの培地に沈殿した細胞を吸引しないように注意してください。これらの細胞と 5 mL の培地をステップ 3.8 にかけます。
- 「CM」チューブ(ステップ3.7から)から3 mLのコンディショニング培地を取り出し、「トリプシン阻害剤溶液」とラベル付けされた15 mLチューブに入れます。.これは、ステップ 3.12 で使用します。3mLを取り出した後、「CM」チューブには7mLのコンディショニング培地が残っています。「CM」チューブをステップ3.9まで脇に置きます。
- T75フラスコに残っている5 mLの培地と細胞を取り出し、「Cells」とラベル付けされた清潔な15 mLチューブに入れます。
- 7 mLのコンディショニング培地(ステップ3.7.1)が入った「CM」チューブを取り、5 mLの血清ピペットを使用して、T75フラスコの底を3.5 mLのコンディショニング培地で2回すすぎます。各すすぎ後、3.5 mLの部分を「Cells」チューブに入れます。このステップの目的は、T75フラスコからすべてのニューロスフェア(細胞)を取り除くことです。
- 「Cells」チューブを100 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞が回転している間に、37°Cの水浴からdPBS/グルコース溶液を取得し、表2に従って適切な量のトリプシンとDNaseを添加します。
- 「Cells」チューブの回転が停止したら、コンディショニングした培地の上清をすべて取り除き、「CM」チューブに移します。
- ステップ3.7.1の「トリプシン阻害剤溶液」とラベル付けされたチューブを取り、表3に示されている量のトリプシン阻害剤を追加します。.トリプシン溶液に使用したのと同じ量のトリプシン阻害剤溶液を使用してください。.
- トリプシン阻害剤溶液を必要になるまで37°Cのウォーターバスに入れます。
- 15mLチューブ内の細胞ペレットにトリプシン溶液を加え、5mLピペットで約5〜10回上下にピペットします。チューブのキャップを閉め、37°Cの水浴で5分間インキュベートします。5分後、細胞を取り出し、5〜10回ピペットで上下します。その後、37°Cのウォーターバスでさらに10〜15分間インキュベートします。
- 最後の5分間で、トリプシン阻害剤溶液をBSCに移します。.
- ステップ2.14が完了した後に細胞を取り出し、球が完全に解離するまで(20〜30回)細胞を上下にピペットで動かします。その後、すぐにトリプシン阻害剤溶液を加え、ピペットで10回上下します。解離した細胞とトリプシン阻害剤のこの溶液は、「細胞懸濁液」と呼ばれます。
- 以下の手順で、細胞懸濁液中の細胞の数を数えます。
- 15 μL の Trypan Blue プレミックス (5 μL の 0.4% Trypan Blue と 10 μL の dPBS を含む) を小さな計量ボートにピペットで移し、5 μL の細胞懸濁液を加えます。ピペットで上下に3〜5回動かして混ぜます。次に、Trypan Blue/細胞懸濁液10 μLをガラスカバースリップで覆った血球計算盤の両側にピペット
で移します。
- 光学顕微鏡で細胞を観察し、4つの角のグリッドのそれぞれに細胞の総数を数えます。これらの数値を合計します。
- もう一方の辺についてもカウントを繰り返し、2つの辺を一緒に平均します。
- この数値に10,000を掛けると、mLあたりの細胞の総数が得られます。この数値にミリリットルの総数を掛けて、細胞懸濁液中の細胞の総数を計算します。T75フラスコあたり500万個の細胞を播種するために必要な細胞懸濁液の量を計算します.
手記： 通常、9〜10日後、T75は25〜30個×106個の細胞を持ちます。したがって、すべての細胞を新しいフラスコに継代する場合、合計5〜6個のフラスコが必要です。
- ステップ3.19で計算した細胞懸濁液の量を各T75フラスコに加えると、フラスコあたり5個×10個の6個の細胞が得られます。容量が5mL未満の場合は、条件培地を追加して合計5mLまで増やします。次に、成長因子(表1)を含む新しいDFHGFPS培地10 mLをフラスコに加えます。
- 手順1.17と1.18を繰り返し、フラスコにセルの種類、日付、フラスコ内のセルの数、および継代番号(セルが継代された回数)がラベル付けされていることを確認します。次に、ステップ4に進みます。
- 必要に応じて、フラスコあたり最大30個×10個の6個の細胞の密度で追加の細胞を1つのT75フラスコに播種し、ステップ4に従って翌日凍結します。
4. hNSCの凍結と保管
- 継代の翌日、凍結用の細胞が入ったインキュベーターからフラスコを取り出します(ステップ3.19および3.22から)。フラスコを傾け、フラスコからすべての培地と細胞を取り出し、15mLのチューブに入れます。次に、チューブを216 x gで5分間遠心分離します。
- 遠心分離プロセスでは、凍結培地を準備します(表4)。5個×10個の6個の細胞ごとに、1mLの凍結培地を調製します。細胞の数は、各フラスコに入れる細胞の数を決定する際のステップ3.19で決定しました。この数は一夜にして変わることはありません。
- 細胞名、継代番号、細胞番号、イニシャル、日付のラベルを貼った凍結保存バイアルを調製します。遠心分離後、吸引して上清を除去し、細胞ペレットを凍結培地に再懸濁して、5 × 106細胞/mLになるようにします。5 mLピペットを使用して、バイアルあたり1 mLを分注し、しっかりと密封します(バイアルあたり5 × 106細胞)。
- バイアルを250 mLのイソプロパノールを入れた凍結保存容器に入れます(最大使用量はイソプロパノールの置換ごとに5回です)。-80°Cの冷凍庫で一晩保管した後、液体窒素タンクの貯蔵システムに移します。
>5. バリデーション用付着性hNSCのめっき
- 通過の前日(ステップ3.1-3.22)に、ステップ2.2と同様にBSCを洗浄し、24ウェルプレートと滅菌ガラス12mmカバースリップを入手します。
- 鉗子を使用して、プレートの各ウェルの底に1枚のカバースリップを置きます。
- カバースリップを含むウェルに0.01%ポリD-リジン(PDL)を滅菌水でコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。24ウェルプレートの場合、ウェルあたり250 μLのPDLを使用します。
- PDLをウェルから取り出し、1 μg/cm2 ラミニン/dPBS(ウェルあたり250 μL)でコーティングします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日に必要ない場合は、パラフィルムをプレートの端に巻き付けてプレートをパラフィルムで密封し、4°C.
で保存します。
手記： ラミニンでコーティングされたプレートは、カバースリップが乾燥しない限り、パラフィルムで密封すれば最大2週間保存できます。
- ステップ3.1〜3.22で説明したように細胞を継代し、次に、コーティングされたカバースリップで24ウェルプレートに播種する細胞の数を決定します。
- 吸引によりウェルから余分なラミニン溶液を取り除き、0.5 mLのdPBSで1回すすぎます。次に、ウェルあたり0.6-1 x 105細胞/ cm2の密度で細胞をウェルに播種します。残りのセルは、手順3.16〜3.21に従って使用します。
- 24ウェルプレート培養中のさまざまな時期に、細胞を固定し、さまざまな幹細胞マーカーを染色します。