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1. iPSCアグリゲートの生成
- iPS細胞コロニーからの単細胞単層培養物の作製
- 基底膜抽出物(BME)コーティングされた6ウェルプレートを調製します。BMEを氷上で4°Cで2〜3時間解凍し、冷たいDulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM-F12;1:50希釈)で希釈し、希釈したBME溶液1 mL/ウェルでプレートを覆い、プレートを4°Cで一晩保存します。
- 6ウェルプレートの少なくとも2つのウェルの培地を吸引し、0.5 mM EDTAのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した後、0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のPBS溶液でコロニーを室温(RT)で4分間インキュベートします。EDTA溶液を吸引し、5mLのDMEM-F12培地でコロニーを皿の底から洗い流してコロニーを穏やかに剥離します。15mLのチューブに集め、遠心分離(RTで1,200 x gで4分間)でペレット化します
注:市販の線維芽細胞から再プログラムされたiPS細胞は、成功裏に使用されてきました。
- 上清を吸引し、iPSCコロニーを500 μLの細胞解離試薬と37°Cで6分間インキュベー
トします。
- 細胞懸濁液を1 mLピペットで数回ゆっくりと上下にピペッティングし、残りの細胞クラスターを単一細胞に分解します。
- 4 mLのDMEM-F12を細胞懸濁液に加えて、細胞解離試薬を希釈します。
- 細胞を1,200 x gでRTで4分間スピンダウンします。
- 細胞を5 μM Y-27632を添加した2 mLのiPS細胞培地に再懸濁し、BMEコーティングされた6ウェルプレートの1ウェルに細胞を播種します><。
手記：材料表に指定されているiPSC培地を、シングルセル単層iPS細胞培養用としてご使用ください。
- 翌日、培地をY-27632が不足している新しいiPSC培地と交換してください。この時点から、iPS細胞が100%コンフルエントになるまで毎日培地を交換しながら、細胞の培養を続けます。細胞株と開始ウェルのコンフルエンシーにもよりますが、これには2〜4日かかります。
- コンフルエントになったら、iPSCを通過します。培地を吸引し、500 μLの細胞解離試薬を細胞に塗布します。
- 細胞を37°Cで5〜10分間インキュベートし、プレートを静かに揺さぶって細胞を剥離します。
- 2mLのDMEM-F12を用いてウェルから細胞を洗い流し、15mLのチューブに回収します。DMEM-F12を添加して総容量5mLにします。
- 細胞を1,200 x gで室温で4分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- 5 μM Y-27632を添加したiPSC培地に、BMEコーティングした6ウェルプレート(2 mL/ウェル培地)に1:2〜1:4の比率で細胞を播種します。
- 細胞を2〜5日間培養し続け、Y-27632が不足しているiPSC培地を毎日交換します。合流したら、iPS細胞を継ぎます(ステップ1.1.4-1.1.8).
手記：iPSCは、材料表に明記されているiPS細胞培地で単層として少なくとも2継代培養してから、細胞が培養条件に適応できるようにiPS細胞凝集体の生成に使用します。
- iPSC凝集体の生成には、単層iPS細胞培養物が70〜90%コンフルエントな場合に使用します.
注:iPSCは、単一細胞が解離および凝集手順中に細胞死につながるストレスを受けにくいため、培養条件に適応しました。単層iPS細胞培養物は、分化の証拠がない典型的な多能性形態を示す必要があります。マイコプラズマ汚染について定期的に培養物を試験します。マイコプラズマフリーのiPS細胞培養のみを使用してください。
- 6ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引し、細胞上に500 μLの細胞解離試薬を塗布します。
- 細胞を37°Cで5〜10分間インキュベートし、プレートを静かに揺さぶって細胞を剥離します。
- 2 mLのDMEM-F12を使用してウェルから細胞を洗浄し、15 mLチューブに回収します。DMEM-F12を添加して総容量10mLにします。
- 細胞計数には、細胞懸濁液から25 μLを取り出し、25 μLのトリパンブルーと混合して死細胞をマーキングします。計数チャンバーを使用して生細胞をカウントします。
- 細胞懸濁液から十分な細胞(iPS細胞凝集体あたり4,500細胞)を15 mLチューブに集めます。
- 細胞を1,200 x gで室温で4分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- 50 μM Y-27632を添加したiPS細胞培地に細胞を再懸濁すると、150 μLあたり4,500個の生細胞が得られます< br />
手記：高濃度のY-27632(50μM)を使用することは、iPS細胞の生存に重要です。
- 低アタッチメントの96ウェルU底プレートの各ウェルに150 μLをプレートし、37 °Cおよび5% CO2.
のインキュベーターに置きます
手記：iPSC凝集体を作製する際は、20日目の品質管理のために少なくとも6つのオルガノイドが必要であることを考慮してください(セクション5を参照)。
2. 前神経外胚葉の誘導
- iPSC凝集体の形態変化を、組織培養顕微鏡下で毎日、4倍または10倍のパワーレンズを使用して綿密に観察します。1日目に観察すると、細胞は明確な境界で凝集します。インキュベーター内でiPS細胞凝集体を37°C、5%CO2.
で培養します。
手記：一定数の死細胞/ウェルは正常であり、オルガノイドの生成に影響を与えません。
- 2日目から1日おきにiPS細胞凝集体を給餌し、底部の細胞凝集体を乱さずに培地の約2/3を穏やかに吸引します。Y-27632.
が不足しているiPSC培地を100μL追加します。
手記：4〜6日以内に、細胞凝集体の直径は350〜450μmになり、滑らかなエッジを示します。
- この段階では、DMEM-F12 と N2 サプリメント (1:200)、B27 サプリメント (1:100)、グルコース (0.2 mg/mL)、環状アデノシン一リン酸 (cAMP; 0.15 μg/mL)、0.5% 非必須アミノ酸 (NEAA)、 1% L-アラニル-L-グルタミン、ヘパリン(10 μg/mL)、および化合物LDN-193189(180 nM)、A83-01(500 nM)、およびWnt応答-1(IWR-1)阻害剤(10 μg/mL)。細胞凝集体を6cm皿に移してから3日後に皮質誘導培地を交換して、細胞凝集体を供給します。
- 皮質誘導中の形態学的変化を組織培養顕微鏡で4倍倍パワーレンズを使用して密接にモニタリングします。
手記：皮質誘導培地で4〜5日後、細胞凝集体の端が表面で明るくなり始め、神経外胚葉の分化を示します。この段階では、偽層状上皮の放射状組織が出現します。セクション 3 に進み、セルアグリゲートを BME マトリックスに埋め込みます。
>3. マトリックス足場への神経外胚葉凝集体の埋め込み
- BMEを氷上で4°Cで2〜3時間解凍し、原液のBMEを十分な量で分注します。
- 埋め込み手順用のプラスチックパラフィンフィルムシートを準備します。滅菌ハサミを使用してプラスチックパラフィンフィルムを4 cm x 4 cmの大きなピースにカットし、プラスチックパラフィンフィルムの一部を空の100 μLチップトレイ(100 μLチップ用)に置き、手袋をはめた指でプラスチックパラフィンフィルムシートに小さなくぼみができるように押します(ディンプル/細胞凝集体が1つ必要)。プラスチックパラフィンフィルムを70%エタノールで洗浄し、密閉滅菌ベンチ下でUV光(出力:15ワット、波長:435nm)を30分間照射します。
- 直径1.5〜2mmの開口部を持つ100μLのカットチップを使用して、各細胞凝集体をプラスチックパラフィンフィルムシートの1つのくぼみに移します。2つの細胞凝集体が融合している場合は、それらを分離せず、1つのくぼみにまとめて移します。
- 未切断の100μLピペットチップを使用して、細胞凝集体を囲む培地を穏やかに吸引します><。
手記：細胞の凝集体を先端に吸い込まないように注意してください。
- 各細胞凝集体に40 μLの希釈されていないBMEを添加します。
- 未カットの100 μLピペットチップを使用して、各セル凝集体をBMEドロップの中央に配置します><。
手記：ピペットチップで発達中の神経上皮を傷つけないように十分注意してください。
- 滅菌鉗子を使用してプラスチックパラフィンフィルムシートを10cmのシャーレ(または別の十分な細胞培養ディッシュ)に慎重に移し、ディッシュをインキュベーターに15〜20分間置いてBMEを固化させます。
- その間、皮質誘導培地5mLが入った低付着性の6cmディッシュを準備します。
- BMEの重合後、プラスチックパラフィンフィルムシートから細胞凝集体を含む液滴を除去します。滅菌鉗子を用いて、プラスチックパラフィンフィルムを裏返し、細胞凝集体をわずかに傾けた(約30°)低付着性の6cmディッシュに、液滴がプラスチックパラフィンフィルムシートから落ちるまで穏やかに絞る。最大16個のセル凝集体を1つの6cm皿に移します。
- 細胞凝集体を37°Cでインキュベートし続けます。
4. 神経外胚葉凝集体からの前脳型オルガノイドの生成
- BMEマトリックスに包埋した1日後、細胞培養インキュベーターに設置した傾斜角5°および14rpmのロッキング細胞培養シェーカーにオルガノイド培養皿を置きます。
- オルガノイドを毎日監視します。BMEマトリックスに包埋した後、均質な神経上皮ループ状構造が徐々に発達します。
- 神経上皮ループ構造が見える場合は、培地をDMEM-F12を含むオルガノイド分化培地に変更し、N2サプリメント(1:200)、B27サプリメント(1:100)、グルコース(0.2 mg / mL)、cAMP(0.15 μg / mL)、0.5% NEAA、1%L-アラニル-L-グルタミン、インスリン(2.5 μg / mL)を含有します。
- オルガノイド分化培地を3〜4日ごとに交換し、目的の分化時点に達するまで行ってください。次に、オルガノイドを固定します(セクション5を参照)
手記：時折、組織はループ構造のない光学的に半透明の組織の芽を示すことがあります。これは理想的ではありませんが、皮質構造の発達に影響を与えていません。オルガノイドは、オルガノイド分化培地で最大40日間培養できます。長期培養期間(40〜100日)の場合、オルガノイド分化培地に1:50 BMEを添加して組織の複雑さを増し、BDNFとGDNFを添加してニューロンの生存と成熟を可能にすることができます。