微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ

サマリー

このビデオでは、我々は細胞の収縮性の変調を評価するための微細加工後のアレイ検出器を（mPADs）の製造と利用する方法を示しています。

要約

このビデオでは、我々は、投稿の微細加工の配列を使用して細胞牽引力を測定するために我々のアプローチを紹介します。牽引力は、ミオシン - アクチンの相互作用を通して生成され、私たちの生理機能に重要な役割を果たしています。開発中に、彼らは、細胞が組織の初期構造を形成する1つの場所から順番に次のに移動することができます。牽引力は治癒のプロセスに役立つ。彼らは傷の適切な閉鎖または私達の体を介して移行し、白血球のクロールに必要です。これらの同じ力は、癌の転移や腫瘍に向かって血管の成長の場合には私たちの健康に有害であることができる。 in vitroで細胞を研究するために使用される、最も一般的な方法は、ガラスまたはポリスチレン皿を使用してきました。しかし、基板の剛性は、それが不可能な物理的に細胞の牽引力を測定すること、および牽引力を研究するために、比較的少数の方法があります。私たちの研究室では、これらの制限を克服する技術を開発しました。方法は、柔軟なカンチレバーの垂直配列、個々の細胞は多くのカンチレバーに分散し、その過程で、それらを偏向するようであるの剛性とサイズのスケールに基づいています。我々が使用する柱は、10μmの高さ、直径3μmの、であり、および9μmの中心間距離との定期的な配列で構成されています。しかし、これらの物理的な寸法は、容易に様々な研究に対応するために変化させることができます。我々は、シリコンのマスターで始まりますが、最後のポストは、ポリ（ジメチルシロキサン）、またはPDMSと呼ばれるシリコーンゴムから作られています。我々は、顕微鏡下でたわみを測定し、観測された変形を作成するために必要な牽引力の大きさと方向を計算することができます。我々は、これらのポストアレイディテクタ微細加工基板、またはmPADsを呼び出します。ここで、我々は細胞の収縮性の変調を評価するためにmPADsを作製および使用方法を説明します。

プロトコル

シリコンマスターモールドの作製

リソグラフィー

材料：

• 75mmのシリコンウェーハ
• SU - 8 2ネガ型​​フォトレジスト（マイクロケム、ボストン、MA）
• N2

方法：

1. 2時間120℃でSiウェハを脱水する。
2. 有機物を除去するために7分間UVオゾンの御馳走の表面。
3. N2ブローの表面には微粒子を除去する。
4. 表面の70％（75 mmウェーハ用〜10 mL）をカバーするためにSU - 8 2を適用します。
5. 300回転/ sの加速度で20秒間2000rpmでスピン。
6. 95℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置
7. 95℃で15分間フォトレジストをSoftbake℃に
8. 洪水は、20のウェハを公開 - 25 mJ/cm2用量を365 nmの（I -ライン）で底層を形成する。
9. 第2フォトレジスト層のためのSU - 8 2を適用します。
10. 約11μmの厚さのフィルムを300rpm / sの加速度で20秒間で550 rpmでスピン。
11. 65℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置
12. ℃で5分間65℃ウエハをSoftbake。
13. 65からホットプレートをランプ℃〜95℃である。
14. 95℃で55分間ウェーハをSoftbake℃に
15. 20分間室温に冷却ウェハ。
16. ウェーハ上mPADマスクの位置を合わせ、95用に公開 - 波長365nm（i線）、100 mJ/cm2用量を。
17. 95℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置
18. 暴露後95℃で25分間、フォトレジストを焼く℃に

開発

材料：

• 100ミリメートルのガラスの皿（5）
• プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（PGMEA）
• イソプロパノール（IPA）
• N2

方法：

1. 化学フードでは、PGMEA（2）、IPA、及びヘキサン（2）5つの料理を埋める。
2. 10秒第1回PGMEAでウェハを保持する
3. 50秒のためのウェハを攪拌
4. PGMEAのメニスカスを伴う第2 PGMEAにウェハを転送する。
5. 5秒間振とうする。
6. PGMEAのメニスカスにIPAにウェハを転送する。
7. 20秒間振とうする。
8. 第一IPAにウェハを転送する。
9. 5秒間振とうする。
10. 第二IPAにウェハを転送する。
11. 5秒間振とうする。
12. すぐにIPAのメニスカスで第二IPAからウェーハを削除し、N2で乾燥
13. パターンを検査する。
14. 120℃14〜20時間、クロスリンクSU - 8でHardbakeウエハ。
15. ダイヤモンドカッターでウェハをダイシング
16. エポキシを使用してスライドガラス上にウェーハをマウントします。
17. （複製の成形の手順を参照）ウェハをFluorosilanize

mPADSの複製成形

負のモールド

材料：

• ボートの重量を量る使い捨てアルミ
• ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース＆硬化剤（ダウ、ミッドランド、MI）
• 黒人
• シラン：（トリデカフルオロ-1,1,2,2 - tetrahyrooctyl）-1 - トリクロロシラン
• ガラススライド
• ガラスパスツールピペット

方法：

1. 気泡を除去するために1時間、真空下での重量とドガによるPDMS 10:1混ぜる。
2. アルミボートでのシリコンのマスターの金型を置きます。
3. 50注ぐ - アルミボートでのマスターモールド上にPDMSの60gを。
4. 気泡を除去するために30分間真空下で脱気する。
5. N2の迅速な爆発とPDMSの表面の気泡を吹き飛ばす。
6. 110対流のオーブンの場所のボートは、℃で15分間、PDMSは、会社になるまで。
7. アルミボートを切り取る。
8. 黒人で、シリコンマスターの下にPDMSを切り落とす。
9. PDMSピール離れてシリコンマスターからゆっくりとマスターを破壊してしまうのを避けるために、一方向に一定の動きで。
10. 損傷のためのシリコンのマスターを点検。
11. 4個に否定的な金型を切り取ります。
12. 否定的な金型の大規模なバッチ1〜10の手順を繰り返します。
13. 酸素プラズマは、表面を活性化するために1.5分のための否定的な金型を扱う、または
14. オゾンは、表面を活性化するために10分間負の金型を扱う。
15. 露出mPAD機能付きデシケーターに否定的な金型を置きます。
16. デシケーターの中央にスライドガラス上にシランの250から500μLを広げる
17. デシケーター内部の先端のシランの150〜200μlのある場所のガラスの牧草地のピペット。
18. > 14時間のためにシランとコート負の金型を蒸発させる真空チャンバー。

mPADS

材料：

• ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース＆硬化剤（ダウ、ミッドランド、MI）
• 広口使い捨てトランスファーピペット
• 2"× 3"ガラスのスライド
• ガラススクライブ
• N2

方法：

1. 気泡を除去するために1時間、真空下での重量とドガによるPDMS 10:1混ぜる。
2. "クロス"にシラン負の金型を締める
3. ピペットPDMSは、負の鋳型に機能が完全に1mmの厚さに覆われているように。
4. 表面に上昇するとPDMSで、気泡のための30分待ちます。
5. 30'ダウンタイムで、N2の流れで埃22x22mm（2号）ガラス製カバースリップ。
6. 酸素プラズマは、ガラスをきれいにし、アクティブにするには1.5分のためのガラススライドの半分を扱う
7. N2の迅速な爆発とPDMSの表面の気泡を吹き飛ばす。
8. 静かにPDMSをプラズマ対向洗浄面にPDMSにガラスカバースリップの端を置く。ゆっくりPDMS完全に接触するように全体のガラス面をスライドガラスを下げ、ガラスのスライドの下に挟ま気泡を避ける。
9. 場所は、20時間℃で完全に治すために110対流式オーブンで金型を組み立てる。
10. オーブンから型を削除し、RTにそれらを冷ます。
11. 離れてトップとゆっくりと皮負で片手mPADを解放するために底部からの否定的な金型でガラススライドをホールド。
12. 折りたたまれた記事のための顕微鏡下でmPADを検査する。
13. プラズマとシラン個置き鋳物を経由して再silanizeモールド。良いレプリケーション用の負の金型の寿命は約60から20のキャストです。

mPADS上に播種細胞

スタンピング

材料：

• UCPのためのPDMSスタンプ（ティッシュエンジニアリングの手法でティエン、J＆チェン、CS、、2001、頁113から120を参照してください。）
• エタノール（100％、70％）
• 滅菌脱イオン水
• 滅菌脱イオン水で50 ug / mlとヒトフィブロネクチン（BD Biosciences社）
• 5 ug / mlとDIIのソリューションは、0.2μmの膜（D - 3886、Molecular Probes社、OR）でろ過
• 2パーセントプルロニックF127（BASF、マウントオリーブ、ニュージャージー州）
• 1Xリン酸緩衝液。
• 100ミリメートルXの25ミリメートルのシャーレ（4）
• 150 × 25ミリメートルペトリ皿（2）
• アルミ箔
• N2
• ピンセット
• 無菌フード

方法：

1. mPADsからトリム過剰PDMS
2. PDMSスタンプが以前に使用されている場合は、夾雑タンパク質を離れてスクラブする5分間100％エタノールでスタンプを超音波で分解する。
3. 無菌フードでは、新鮮な100％エタノールと滅菌水でスタンプを浸漬した後、ピンセットとN2で乾燥して、その両側にスタンプを保持する
4. 側を上に働くと150ミリメートルのペトリ皿の場所。
5. アリコートを各スタンプにフィブロネクチンソリューションの滴。最後にして切手の各コーナー、エッジ、および内陸部で始まります。最初にタイムスタンプのPDMSの表面は疎水性であるが、タンパク質が吸着される親水性になる。フィブロネクチン溶液の少量生産が完全にコートスタンプに必要とされるように変更PDMSの接触角"OutsideからInside"の作業。
6. タンパク質吸着用フードで1時間放置します。
7. 皿に注ぐと、スタンプ上の水位の上昇をできるようにすることで、DI水でスタンプを洗ってください。
8. DI水で満たされた100ミリメートルのペトリ皿にスタンプを洗ってください。
9. 削除し、N2で乾燥させます。
10. オゾンは、スタンプのために表面を活性化するために7分間mPADSを扱います。
11. ボンネットの下に、mPADにスタンプのエッジを置き、静かに完全に接触するために下げることによってmPADSをスタンプ。軽くすべての領域が良好な接触を持って確保するためにピンセットで切手の上部をタップするだけの記事を折りたたむしないように注意してください。
12. 慎重にピンセットでスタンプを削除します。
13. 〜15秒間100％のエタノールでは、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。料理との間で迅速に転送することにより、転送中にディウェッティングによるマイクロニードルを保つ。
14. 〜15秒間、70％エタノールで100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。
15. 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。
16. 〜15秒のための純水で2番目の100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。
17. 純水で150ミリメートルのペトリ皿で​​水没のmPADS。
18. DIIの溶液100 mLで150ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。
19. アルミ箔で覆い、1時間浸す。
20. 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。
21. 2％プルロニック10mlと0.2％プルロニックの総濃度のPBS 90 mLで150ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。
22. 表紙と1時間浸す。
23. 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。
24. 〜15秒のための純水で2番目の100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。
25. 〜15秒のためのPBSで3位100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。

種まき

材料：

• 選択された細胞株
• トリプシン- EDTA（EDTA•4NA、ギブコの猫と、0.25％トリプシン号25200〜056）
• 成長中
• 1Xリン酸緩衝液。

方法：

1. 無菌フードが100mmのペトリ皿の場所のmPADSと、17 mLの培地を詰めます。
2. 37 ° Cを温めるためにインキュベーターにペトリ皿を置き、
3. トリプシンで細胞を懸濁し
4. 細胞のクラスターを分割することを繰り返し吸引する。
5. mPADS付きペトリ皿にピペットで細胞懸濁液。彼らは分析の時点で、単一の細胞（細胞間接触せずに）残るようなセルを追加します。追加するセルの正確な量は、細胞型特異的であり、細胞の拡散領域と成長率に依存します。
6. 静かにゆっくりとpippettingとペトリディッシュ内の細胞を分散させる。
7. 細胞が沈殿し、マイクロニードルに付着できるようにするために2時間インキュベーター内の場所。
8. 細胞が拡がっているかどうかを確認するmPADSを点検。細胞は扁平に見えるし、6以上の投稿をまたがる予定。
9. 細胞が散在している場合は、新鮮な培地21 mLで新しい100ミリメートルペトリ皿にmPADSを転送する。
10. mPADSは、実験の準備ができている。

mPADSを染色し、マウント

固定

材料：

• 脱イオン水
• Paraformeldahyde（16％）バイアル
• 10Xリン酸緩衝液。
• 1Xリン酸緩衝液。

方法：

1. 50mLの遠沈管に、DIの30mLを、paraformeldahyde 10 mLの（全体のバイアル）、および固定液のための10 × PBS 4.5 mLを加える。
2. 100ミリメートルペトリ皿にソリューションを固定する〜25 mLを加え。
3. ゆっくりと水没は皿を固定に細胞とmPADと20分間インキュベートすることができます。
4. 1X PBSで3回100 mmディッシュで水没のmPADS。
5. 免疫染色してマウントするための準備。

mPADSで携帯軍の分析

共焦点像

材料：

• 共焦点顕微鏡
• 63X対物
• 二次抗体のフィルターキューブ
• マイクロニードルのDIIイメージングのためのグリーンフィルタキューブ（ローダミン）。

方法：

1. 場所のステージ上でmPADsと300ミリ秒の露光で、単一の細胞を見つけること、ないビニング。
2. TOP IMAGEのためのマイクロニードルの画像のトップス。
3. Z -制御の読み出しを使用して、下の画像のためのマイクロニードルのイメージをキャプチャします。
4. 画像はの汚れ（ヘキスト、ファロイジンなど）を持つ他のチャンネルを

画像解析

材料：

• Image Processing ToolboxにあるMATLAB

方法：

1. 上部と下部の画像を回転して登録
2. 底面の重心（undeflected）と上部（偏向）の位置を測定
3. 変位を計算する
4. 投稿（知られている、後のジオメトリに依存する）のためのばね定数を使用して、各ポストに力のベクトルを計算する
5. エラーの分析は、力を解決する能力に基づいており、画像の解像度と重心検出の分解能に依存しています
6. さまざまな条件等を介してなど、力の大きさ及び/または方向、時間の経過として、多くの測定 - あなたのカスタマイズされたニーズに従ってデータを整理