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1. iPS細胞の培養とBECの分化に必要な材料の準備。
- IMR90-4 iPS細胞培養用組織培養(TC)プラスチックのマトリックスコーティング
- 基底膜マトリックスゲル(例:.、マトリゲル)を2.5 mgアリコートに分注し、-20°Cで保存します。
手記： マトリックスゲルと分注を氷上で取り扱うときは、4°C以上でゲルを形成し、固化すると分注できないため、迅速に作業してください。
- TCプラスチックをコーティングするには、50 mLコニカルチューブ内の30 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12培地にマトリックスゲル1アリコートをすばやく加えます。凍結したマトリックスゲルに培地1 mLを加え、解凍するまでピペットで上下に動かし、残りの培地ですぐに50 mLのコニカルチューブに移します。
- このマトリックスゲルコーティング溶液は、6ウェルプレートのウェルあたり1 mL、T75フラスコあたり12 mLを使用します
手記：マトリックスゲルコーティングされたTCプラスチックは、使用の2週間前まで調製できます。ただし、マトリックスゲル溶液が乾燥し、ウェルの上にDMEM/F12を時折追加する必要があるため、それを回避することが重要です。
- バイオセーフティキャビネットの無菌環境で、50 mLの50xサプリメントを450 mLの幹細胞維持基礎培地に加えて、幹細胞維持培地を調製します。
- 500 mLの非コンディショニング培地(UM)を調製するには、392.5 mLのDMEM/F12を100 mLのノックアウト血清置換(KOSR)、5 mLの非必須アミノ酸、最終濃度1 mMのL-グルタミン、および3.5 μLのβ-メルカプトエタノールと組み合わせます。フィルター滅菌し、4°Cで最大2週間保存します。
- 200 mLの内皮細胞(EC)培地、レチノイン酸(RA)およびbFGFを調製するには、198 mLのヒト内皮無血清培地(hESFM)、2 mLのフィルター滅菌済み血小板貧乏由来血清(PDS)、および20 ng/mL bFGFを組み合わせます。フィルター滅菌し、4°Cで最大2週間保存します。細胞に添加する直前に、10 μMのRAをEC培地に添加します.
手記： PDSは廃止され、したがって制限される可能性があるため、このプロトコルはPDSの代わりにB27を使用して成功裏に実施されています。
- RAまたはbFGFを含まないEC培地200mLを調製するには、198mLのhESFMと2mLのフィルター滅菌PDSを組み合わせ、フィルター滅菌します。4°Cで最大4週間保存してください。
2. ヒトiPS細胞からの脳内皮細胞の分化
- 分化のためのiPS細胞のプレーティング(分化プロトコルの-3日目)
- 分化のためのプレート、培地の吸引、ウェルあたり1 mLの酵素細胞解離試薬の添加、および37°Cで7分間のインキュベートに使用したIMR90-4メンテナンス培養ウェルごとに
。
1 - mLの解離細胞懸濁液を、細胞1 mLあたり少なくとも2 mLの新鮮な幹細胞維持培地を入れた15 mLのコニカルチューブに移すことにより、酵素細胞解離試薬を不活性化します。細胞懸濁液を1,500 x gで5分間スピンダウンします。
- 使用したIMR90-4細胞のウェルあたり1 mLの幹細胞維持培地に細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします><。
手記：0.4%トリパンブルーで1:1に希釈すると、生細胞と死細胞を区別することができます。iPS細胞の密度にもよりますが、6ウェルプレートの1ウェルで通常1-106個の細胞が得られます。
- T75フラスコで分化するには、7.5 x 105細胞を12 mLの幹細胞維持培地とROCK阻害剤(Y27632二塩酸塩)の最終濃度10 μMで添加します。フラスコを前後左右に振って細胞を均等に分散させ、37°Cおよび5%CO2.
でインキュベートします。
手記：このステップでROCK阻害剤を添加することは、解離した単一幹細胞の生存率を高めることが重要です。細胞は、フラスコ全体およびROCK阻害剤処理により広がった間葉系様形態を示すシングレットに均一に分布している必要があります。
- -2日目と-1日目に、培地を新鮮な幹細胞維持培地(T75あたり12 mL)に交換します。
- 0日目に、培地をUMに変更して分化を開始します;T75あたり12mL。
- UMを毎日変更します(1日目から5日目).
手記：細胞は通常、UMで2〜3日後にコンフルエントに達し、肉眼または倒立明視野顕微鏡で観察できます。分化が進むと、nestin+の「神経管」が見え、その間にPECAM-1+細胞が挟まれます。
- 20 ng/mL bFGFと10 μMレチノイン酸(RA)を含むEC培地に切り替え(6日目)、2日間インキュベートすることにより、内皮細胞集団を選択的に増殖させます。bFGFを含むEC培地は、2週間前まで調製できます。RAは、使用日に凍結ストックから添加されます(例:EC+bFGF1 mLあたり10 mM RAストック1 μL)
手記：良好な分化は、6日目と8日目にRAを補給しなくても達成できます。ただし、RAを省略すると、TEERが減少したBECが生成されます。
- 細胞培養プレートとメンブレンインサート(トランズウェルなど)をコラーゲンIVとフィブロネクチンでコーティングし(7日目)、BECの精製とその後の実験のために。
- メンブレンインサートのコーティングには、コラーゲンIV4部(0.5 mg/mL酢酸に1 mg/mL)、フィブロネクチン1部(1 mg/mL)、および滅菌組織グレードの水5部を組み合わせます。ECM溶液は、細胞培養プレート(コラーゲンIV4部、フィブロネクチン1部、水45部)をコーティングするために1:5に希釈することができます。コーティング溶液と37°Cで一晩インキュベートします.
注:プレートとメンブレンインサートは、精製ステップの同日に継代培養する前に、少なくとも4時間コーティングすることもできます。
- 分化した細胞をコラーゲンIVおよびフィブロネクチン被覆プレートまたはメンブレンインサートで継代培養することにより、BECを精製します(8日目)。
- EC培地を吸引し、酵素細胞解離試薬(T75あたり12 mL)を添加します。細胞の90%がフラスコから分離するまで、37°Cでインキュベートします
手記： 細胞の解離には最大1時間かかる場合があります。
- インキュベーション時間中に、事前に準備したプレート/インサートからコラーゲンIV/フィブロネクチンコーティング溶液を取り出し、滅菌フードで乾燥させます。インサートが乾くまで約20分かかります。
- 細胞が分離したら、10mLピペットを使用してフラスコから洗い流します。ピペットを上下に動かして、シングルセル懸濁液を実現します.
手記：シングルセル懸濁液は、信頼性の高いセルカウントと固体単層の達成に重要です。
- 50 mLの円錐形チューブで少なくとも等量の新鮮なhESFMで希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 細胞を1,500 x gで10分間ペレット化します。
- 調製したばかりのEC + bFGF + RAを適切な量の細胞に再懸濁し、メンブレンインサートへの播種用に2 x 106細胞/mLの懸濁液が得られます。12ウェルインサートの上に500 μL(1 x 106細胞)を、底面に1.5 mLのEC + bFGF + RA培地を加えます。24ウェルプレートおよび48ウェルプレートに播種する場合は、細胞懸濁液を1:2で希釈し、ウェルあたりそれぞれ500 μL(5 x 105細胞)および250 μL(2.5 x 105細胞)を添加します。細胞をウェル/インサート全体に均等に分布させ、5% CO2 で 37 °C でインキュベートします。
- プレート/トランズウェル上の培地をbFGFまたはRAを含まないECに交換します(9日目)。