マウス腹膜脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離

要約

出典:Qi, Y., et al.Isolation Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue.J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、マウスの大動脈周囲弓脂肪組織から蛍光標識された神経堤由来脂肪由来幹細胞(ADSC)を単離および培養する技術を示しています。単離後、NCADSCsを検出し、蛍光活性化細胞ソーティング法を用いて選別した後、プレート上で培養することで細胞増殖を促進します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 間質血管分画(SVF)の分離

5-6匹のマウスの大動脈周囲弓脂肪組織(PAAT)を、新たに調製した消化培地1mLを含む2mLの微量遠心チューブ1本に集め、エッペンドルフチューブの手術用ハサミを用いて室温(RT)で組織をミンチにします。

1. 混合物を9 mLの消化培地を含む50 mLチューブに移します。1 mLピペット10xでピペッティングして組織を均質化します。
2. チューブを37°Cでインキュベートし、100 rpmで30〜45分間絶えず振とうし、過剰消化を防ぐために5〜10分ごとにチェックします。これは、細胞の生存率と収量を改善するために重要です
   手記：組織の消化が良好になると、チューブを静かに渦巻くと肉眼で見える均質な淡黄色の脂肪組織が得られます。
3. 10% FBSおよび1% v/v PSを含むHDMEMを5 mLRTで添加して消化を停止し、ピペッティングでよく混合します。
4. 細胞懸濁液を500 x gでRTで5分間遠心分離します。SVFは茶色がかったペレットとして表示されます。浮遊脂肪細胞を慎重に吸引し、SVFを乱さずに残りの上清をデカントします。SVFペレットを10 mLの培地に溶解し、70 μmの細胞ストレーナーでろ過します。
5. 細胞懸濁液を500 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを15 mLの赤血球溶解バッファー5 mLに15 mLのコニカルチューブで10分間室温で穏やかに再懸濁します。
6. 1% FBSを含む1x PBSを10 mL加えて反応を停止します。細胞懸濁液を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、1% FBSを含む1x PBSの10 mLにペレットを再懸濁します。
7. 細胞を再び500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、ペレットを5 mLの培養培地に再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに入れ、4°Cで
保存します。
8. 最終遠心分離(500 x g、5分間、4°C)した後、ペレット化した細胞を5 mLのFACSバッファー(10% FBS、100 units/mL DNA I、および1% v/v PS)に氷上に再懸濁し、血球計算盤で細胞をカウントします。

2. FACSによるNCADSCの分離

1. セルソーターのセットアップと最適化は、取扱説明書に従って行ってください。100μmのノズルを選択し、収集チューブを滅菌し、必要な収集装置を取り付け、サイドストリームを設定します。
2. RFP+細胞のソーティングには、561 nmのイエロー/グリーンレーザーと光学フィルター579/16が推奨されます。ネガティブコントロールとシングルステインポジティブコントロールを使用して補正を行います。ゲート方式については、図 1A を参照してください。
3. 細胞を40μmストレーナでろ過し、500 x gで5分間遠心分離し、0.5〜1 x 10⁷ / mLの密度で2 mLのFACSバッファーに再懸濁します。細胞を明確に標識された5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移し、ソーターにロードします。
4. 実験用サンプルチューブを4°Cで泳がせ、デフレクションプレートをオンにして、1% FBSと1% v/v PS.
   を含むRPMIでプレコートされた15 mLのコニカルチューブに選別します。 手記：RFPクエンチングを最小限に抑えるために、サンプルを強い光から保護します。

3. NCADSCの文化

1. 選別した細胞を5,000細胞/cm²の密度で12ウェル培養プレートに播種し、完全培地で5%_CO2を含む湿度の高い雰囲気で37°Cで20〜24時間インキュベートします。
2. 培地を取り出し、予熱した(37°C)PBSで細胞を洗浄して細胞の破片を取り除き、新鮮な培地を加えます。

結果

図1:PAATから単離されたNCADSCの脂肪形成分化。 (A)NCADSC(RFP)集団を特徴付けおよび分類するための一般的なゲーティングスキーム。(B)蛍光顕微鏡画像は、NCADSCが12ウェル培養プレート上で96時間播種した後に付着し、膨張したことを示しています。(C-G)脂肪形成誘導後にPAATのNCADSCをオイルレッドOが染色したことを示す代表的な画像。(C)制御(誘導なし)。(D)一次NCADSCおよび(E)白色脂肪原性誘導の10日後の3回継代NCADSC。(F)一次NCADSCおよび(G)褐色脂肪原性誘導の10日...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BSAの	VWRライフサイエンス	0332-100グラム	使用濃度 50 mg/mL; ロット #: 0536C008
コラゲナーゼ、I型	ギブコ	17018029
赤血球溶解バッファー	インビトゲン	〒00-4333
FBSの	コーニング	R35-076-CV	使用濃度 50 mg/mL; ロット #: R2040212FBS
HBSSの	ギブコ	14025092
HDMEM	ゲライフサイエンス	01 SH30243日	ロット #: AD20813268
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	ABCONE(中国)	P41970
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122

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