マウスの粘膜下層および固有層からの腸管グリア細胞の単離

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 滅菌ポリ-D-リジン(PDL)およびラミニン溶液の調製

1. 細胞単離の少なくとも1日前に、ポリ-D-リジン(PDL)およびラミニンコーティングプレートを調製します
   手記：6ウェルプレートと12ウェルプレートの両方を、実験目標に応じて調製しました。通常、ウェスタンブロットを用いた定量分析には12ウェルプレートを使用し、免疫組織化学用のオートクレーブ(滅菌)カバースリップを保持するために6ウェルプレートを使用しました。24ウェルプレートを使用して、Ca²⁺フラックスイメージング用の腸管グリア細胞(EGC)を培養しました。
2. HEPAフィルター付き空気を入れた組織培養フード内で、超高純度組織培養グレード、DNaseフリー、およびRNaseフリーの水でストック溶液を希釈します。
3. ガラスカバースリップの滅菌
   1. 滅菌鉗子でカバースリップを保持し、カバースリップを100%エタノールのビーカーに15分間浸し、エタノールを組織培養フード内で蒸発させてから、6ウェルプレートに入れます。
   2. あるいは、プラスチック容器に入った厚さ2mmのあぶらとり紙に複数のカバースリップを個別に置き、オートクレーブします。

2. コーティングプレート

>注:これらの手順は、滅菌組織培養層流フードの下で行ってください。

1. PDLストック1 mg/mLを解凍し、無菌の組織培養グレードの水で1:10に希釈して、最終濃度が100 μg/mLになるようにします。6ウェルプレートのコーティングにはウェルあたり2 mL、12ウェルプレートの1ウェルをコーティングするには1 mL、24ウェルプレートの1ウェルには0.5 mLを使用します。残りの希釈PDLを12 mLアリコートに入れ、-20°Cで保存します。
2. PDLをウェルに少なくとも1時間コーティングした後、滅菌ピペットでPDLを取り出します。プレートを組織培養層流フードの下で完全に風乾させます.
   手記：PDL溶液を滅菌ピペットで取り除いた後、0.22μmフィルターを通過して4°Cで保存した後、1週間以内にさらに2回使用できます。
3. ゲル形成を避けるために、ラミニンストックを氷上で解凍します.
   手記：希釈されていないラミニンは、8°C以上で温めると固体になります。
4. ラミニンストック(0.5 mg/mL)を滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1:50に希釈し、最終濃度10 μg/mLにします。希釈したラミニンを12 mLアリコートに入れ、-20°Cで保存します。
5. 乾燥PDLを含むウェルに希釈ラミニンを加えます。1 mL で 6 ウェル表面を覆い、0.5 mL で 12 ウェルプレートの底を覆います。カバーガラスの場合は、400 μLの希釈ラミニンをカバーガラスに加えて、表面を覆います。
6. コーティングされたプレートを37°Cで2時間インキュベートします(プレートを同じ日に使用した場合)(クイックコーティング)。そうでない場合は、プレートをラップで密封し、4°C(スローコーティング)で一晩保管します
   手記：乾燥や汚染を避けるためには、シーリングが重要です。
7. 表面を傷つけないように、ピペットでラミニン溶液を慎重に取り除きます。ウェルを滅菌DPBSで3回優しく洗浄します。
8. 各ウェルに完全なグリア増殖培地を添加し、EGC懸濁液を添加する準備ができるまでプレートを37°Cに保ちます.
   手記：Poly-Dリジンおよびラミニンコーティングされたプレートは、4°Cで3日間保存できます。滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でプレートを3回洗浄します。最終洗浄後、各ウェルに2 mLの滅菌DPBSを添加します。プレートをパラフィルムで密封し、4°Cで保存します。ラミニンが乾燥しないようにすることが不可欠です。

>3. アイソレーション溶液の調製

1. EDTA/HEPES/DPBS解離溶液を調製します。500 mLの溶液に対して、滅菌DPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)を使用して、10 mM HEPESと5 mM EDTAの最終溶液を調製します。490 mLのDPBSに、5 mLの1 M HEPESバッファーと5 mLの0.5 M EDTAストック溶液を添加します。使用するまで4°Cで保管してください。
2. 表1にリストされている試薬を使用して、グリア細胞再懸濁培地を調製します。
3. Table 2.
   にリストされている試薬を使用してグリア増殖培地を調製します。 手記：GDNFを含むグリア増殖培地は、4°Cで1週間保存できます。

4. 腸の部分の除去

>注:マウスは、イソフルラン滴下法と重要な臓器の摘出により、安楽死前に食物と水への自由なアクセスを許可されました。8週齢以上のC57BL/6マウスを用いた。両方の性別が使用されましたが、準備に目立った違いはありませんでした。

1. イソフルランの過剰摂取でマウスを安楽死させ、解剖トレイに仰向けに置きます。四肢を固定し、腹部を70%エタノールで滅菌します。鉗子で皮膚をテントで覆い、はさみで腹部を開きます。
2. 肝臓を持ち上げ、遠位胃/幽門を特定します。次に、近位腸を7cm切除します。腸を引き裂かないように注意してください。
3. 鉗子で幽門を持ちながら、腸間膜を切り取ります。
   1. はさみの後ろで鈍い解剖を使用して、付着した膵臓をこすり落とします。
   2. 腸セグメントをCa²⁺またはMg²⁺を含まない氷冷DPBSに入れます(図1A).
      手記：腸や結腸の他の部分も、同じ技術を使用して除去できます。
4. 鈍い端の20 G針に取り付けられた5 mLまたは10 mLのシリンジを使用して、氷冷したDPBSで糞便内容物を洗い流します(図1B)。
5. 腸を3cmのセグメントに分割して、縦方向の筋肉を取り除きます。注:HEPES/EDTA/DPBS分離溶液30mLあたり、最大2匹のマウスの腸セグメントが使用されます。
6. 木の棒を綿の先端から離すために約4cm折ってください。木の棒をDPBSに浸します(図1C)。
7. 腸のセグメントの1つを接液スティックにスムーズに滑り込ませます(図2A-C)。
8. 針鼻鉗子を使用して、まだ付着している付着性腸間膜を取り除きます(図2D)。
9. 清潔なカミソリの刃またはメスを使用して、腸間膜が付着した腸に沿って2つの縦方向の切り傷を作ります(図2E)。
   1. 綿の先端をDPBSで濡らします。濡らした綿の先端を筋肉に沿って縦にこすり、縦方向の筋肉/筋神経叢(LMMP)を緩めます。次に、LMMP除去中に綿の先端を水平に動かして、腸のセグメントの長さに沿って輪状筋からLMMPをからかいます。
   2. スティックの先端を親指と人差し指で挟みながら、中指と4本目の指でセグメントを固定します(図2F)。完成すると、LMMPは腸の部分を簡単に剥がすことができます。
10. 腸管から剥がして綿棒に付着させたLMMPは、腸管からEGCを採取することが望ましくない場合を除いて、廃棄します。
11. かみそりの刃を使用して腸のセグメントを縦方向に開き、木の棒から取り除きます。
12. 剥がれた腸組織(主に粘膜、粘膜下組織、輪状筋)を氷上のDPBSに保存します。すべての腸のセグメントが準備されるまで、手順4.4〜4.11を繰り返します。

5. 上皮粘膜の除去

1. 腸を細いハサミで~0.5cmの小さめに切ります。
2. 組織を、30 mLの氷冷EDTA/HEPES/DPBS溶液が入った滅菌済みの50 mL円錐形遠心チューブに入れます。
3. 組織含有溶液を4°Cで10分間、~60チルト/分で揺さ
ぶる。
4. 5 mLのプラスチックピペットでEDTA/HEPES/DPBSバッファーを1回上下にピペッティングして予め湿らせてから、事前に湿らせたピペットを使用して組織とバッファー懸濁液を上下に20回ピペット(トリチュレーション)して上皮粘膜を取り除きます。
5. EDTAインキュベーションから組織を採取し、混合物を100 μmのナイロンセルストレーナーに注ぎます。濁った粘液で満たされたフロースルーを廃棄します(図3)。
6. ストレーナーに保持した組織を、針鼻鉗子を使用して30 mLの氷冷EDTA / HEPES / DPBSを含む新しい50 mLコニカル遠心分離チューブに入れます。.
7. 組織を4°Cで10分間、毎分~60回傾けて揺さぶることにより、EDTA/HEPES/DPBSインキュベーションを2回繰り返し、追加の上皮粘膜を剥離します。
8. 5mLのピペットを緩衝液であらかじめ湿らせてから、組織懸濁液を上下に20回ピペットで動かして粘膜細胞を取り除きます
   手記：上皮の多くが除去されるにつれて、組織はピペットの内側にくっつく傾向があります。
9. 2回目のインキュベーション後、混合物を100μmのナイロンセルストレーナーに注いで組織を採取し、流れを捨てます。2番目のフロースルーは、最初のフロースルーよりも明らかに濁りが少ないはずです(図3)。
10. 溶液がほぼ透明になるまで、10分間のEDTAインキュベーションを繰り返します(組織の量とトリチュレーションの有効性に応じて約3〜4回のインキュベーション)(図3)。

6. 固有層と粘膜下層からの腸内グリア細胞の採取

1. ナイロンストレーナーから組織を、市販の細胞回収溶液5 mLが入った15 mLの円錐形遠心分離チューブに移し、4°Cで25〜30分間振とうします。
2. 腸管グリア細胞を固有層から解離するために、穏やかに10倍に滴下します。
   1. 40 μmフィルターでろ過し、濾液を清潔な50 mLチューブに集めます。
   2. ナイロンフィルターのティッシュを1mLのDPBSですすいでください。
   3. 組織を廃棄し、~5〜6 mLの濾液を清潔な15 mLの円錐形遠心チューブに移します。
   4. 濾液をスイングバケット遠心分離機で2,000 x gで4°Cで5分間回転させます。
3. グリア細胞含有ペレットを少なくとも1 mLの再懸濁バッファーに再懸濁するには、500 μLのピペットチップでペレットを穏やかにピペッティングします。気泡の導入を避けてください.
   手記：ウェル数とプレート数に応じて、必要に応じて再懸濁量を調整します。例えば、6 ウェルプレート 1 枚に 1.2 mL、6 ウェルプレート 2 枚に 2.4 mL、12 ウェルプレート 1 枚に 2.4 mL です。
4. 細胞懸濁液200 μLを6ウェルの各ウェルにピペットで挿入するか、グリア増殖培地を含む12ウェルPDL-ラミニンコーティングプレートの場合は100 μLをピペットで注入します。
5. 細胞をプレートに加え、最大数の細胞が付着するように37°Cインキュベーターに入れた後は、皿を邪魔しないでください.
   手記：健康な細胞調製物は6〜8時間以内に付着しますが、少なくとも24時間待ってから、非接着性細胞とともに培地を静かにピペッティングして培地を交換してください。
6. 細胞を培養に入れてから3〜4日後に実験に使用します(図4)。

>表 1.グリア細胞再懸濁培地の組成。

>表 2.グリア細胞増殖培地の組成

図1:マウス腸のセットアップと準備。(A)抽出された腸を含む氷上に設置された分離の写真。(B)糞便の内容物を洗い流すために20Gの鈍い端の針に取り付けられた5mLの注射器の写真。(C) DPBS バッファーに浸した木製綿棒 (~4 cm) のエンジニアード エンド。

図2:腸を洗浄し、縦筋/筋神経叢(LMMP)を切除するために使用される手順。(A-C)腸の部分を濡れた木の棒にスライドさせます。(D)付着性腸間膜の除去。(E)かみそりの刃で腸を刻む。(F)広告でLMMPを取り外すamp 綿棒。

図3:EDTAインキュベーション後のシーケンシャルフロースルー。示されているのは、DPBSで5 mM EDTA/10mM HEPESと10分間インキュベートした3つの7 cm腸セグメントを使用した4つの連続インキュベーションからのフロースルーの例であり、その後20回トリチュレーションしたものです。100 μmのナイロンメッシュストレーナーに流し込んだ後の代表的なフロースルーを示します。

図4:めっき後24時間のEGC画像。めっき後24時間で再懸濁した細胞の光学顕微鏡検査。(A)示されているのは、浮遊上皮細胞の塊(矢印)と破片を示す貧弱な調製の代表例です。(B)示されているのは、細胞単離および再懸濁の24時間後にEGCのパッチがPDL/Lamininコーティングプレートに付着した優れた調製の代表的な例である。画像は、デジタルカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡で撮影されました。スケールバー = 500 μm (A-B) (C) GFAP抗体で染色したEGC細胞のパッチの高倍率表示(緑色)で、標識強度の高い末梢の細胞を示しています。いくつかの細胞は二重核を示しました(矢印、DAPI、青)。(D)GFAP(緑)とS100(赤)またはp75NTR(赤)の共局在。スケールバー = 20 μm (C-D)。細胞には、退色防止剤とDAPI(青色核)をマウントしました。