ブタの脳からの毛細血管の浄化

要約

出典:Nielsen, S. S. E., et al. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、新鮮なブタの脳からの毛細血管の分離を示しています。このプロセスには、髄膜の除去、脳組織からの灰白質の分離、灰白質の均質化とろ過による毛細血管の分離、そして最後に酵素消化を使用して毛細血管をさらに精製することが含まれます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ブタ脳毛細血管の浄化

1. 生後5〜6か月の家畜豚(近くの食肉処理場など)から8〜10個の脳を収集し、氷上で実験室に輸送します。動物の終了後2〜3時間以内に次の精製手順を開始することをお勧めします。
2. 脳を滅菌フローベンチに置き、氷の上に置いたビーカーで1LのPBSで優しく洗います。
3. 細い先端の鉗子を使用して一度に1つの脳から髄膜を慎重に取り除き、髄膜のない脳を別の1Lビーカーに移し、PBSを氷の上に置きます。所要時間を長くすると、削除が複雑になる可能性があります。各脳に使用されるおおよその時間は10〜15分である必要があります。
4. メスを用いて、一度に1つの脳から灰白質を掻き取り、分離した物質を氷上に置いた20mLのDMEM栄養混合物F-12(DMEM/F-12)を含むシャーレ(8.8cm2)に移します。白質物質を回収せずに、できるだけ多くの灰白質を分離します。最初の断片化では、灰白質材料を針なしで50 mLシリンジに通します。すべての脳について続け、収集した灰白質材料をプールします。所要時間を長くすると、削除が複雑になる可能性があります。各脳に使用されるおおよその時間は10〜15分である必要があります。
5. 分離された灰白質材料をハンドヘルド組織ホモジナイザーのグラインダーチューブにDMEM / F-12培地と50/50の比率で移します。緩い乳棒で8回の上下ストロークを行い、続いてきつい乳棒で8回の上下ストロークを行うことで、材料を均質化します。すべての単離された材料が均質化されるまで続け、次にホモジネートを500 mLボトルに移し、DMEM/F-12で約450 mLの総容量に希釈します。
6. フィルターホルダーと140 μmフィルターメッシュ付きの500 mLブルーキャップボトルを使用してホモジネートをろ過し、組織をフィルターに通して毛細血管を分離します。ホモジネート50 mLあたり1つのフィルターを使用し、その後、各フィルターをDMEM/F-12で洗浄します。
7. トリプシン/EDTA(2.5 % トリプシン、PBS 中 0.1 nM EDTA)、コラゲナーゼ CLS2(2,000 U/mL)、および DNase 1(3,400 U/mL)の DMEM/F-12 の消化溶液を入れたシャーレに、毛細管含有フィルターをセットします。フィルターメッシュ3枚につき1枚のシャーレ(8.8 cm²、20 mL溶液)を使用します。
8. ペトリ皿を37°Cで1時間、180rpmのオービタルシェーカーに置くか、10分ごとに穏やかに攪拌します。1時間後、1mLピペットを使用して、ペトリ皿からの懸濁液でフィルターから毛細血管を洗い流します。
9. 3つのディッシュからの懸濁液を2つの50 mLチューブに分割し、各50 mLチューブに10 mL DMEM / F-12を追加して消化を停止します。.
10. 細胞懸濁液を250 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引し、各ペレットを10 mLのDMEM/F-12に再懸濁します。さらに20 mLのDMEM/F12を各チューブに加えます。この遠心分離ステップを2回繰り返します。
11. チューブを氷の上で5分間冷まし、溶液を2本の新しい50mLチューブに移します。
12. 細胞懸濁液を250 x g、4°Cで5分間遠心分離し、各ペレットをFBS中の10%DMSOからなる8〜10 mL(約1 mL/脳使用)の凍結溶液に再懸濁します。
13. 細胞懸濁液をクライオバイアルに移し、クライオバイアルあたり1 mLを使用します。平均して、精製は使用される脳ごとに1バイアルをもたらし、平均して12〜16個のインサートに内皮細胞を提供します。バイアルを-80°Cの冷凍ボックスに入れ、少なくとも4時間から一晩中置きます。その後、クライオバイアルを液体窒素を入れたクライオタンクに保管します.
    注意：液体窒素は極めて低温です。適切な保護具を着用してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F-12	ロンザ	BE12-719F
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ Invitrogen	10-270-106
トリプシン/EDTA	ギブコ Invitrogen	15090-046
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	34896
PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8537
DNAse 1	シグマ・アルドリッチ	D4513
コラゲナーゼCLS2	シグマ・アルドリッチ	C6885
ddH2O(ディーディーエフ2O)			Elgaシステムで作られています
15ml遠心分離管	セルスター	188271
50mlの遠心分離管	セルスター	227261
ペトリ皿	サーモサイエンティフィック	150350
クライオバイアル	サーモサイエンティフィック	377224
500mlボトル	サーモサイエンティフィック	159910/159920
メス	スワン・モーテン	REF0211	タイプ24
組織ホモジナイザー	シグマ	D9188
140 μmフィルター	メルク	NY4H04700
細い先端の湾曲した鉗子	KLSマーティン	12-409-12-07
ブロードチップ鉗子	VWRの	82027から390
フィルターホルダー	メルクミリポア	スウィネックス-47
50mlシリンジ	ブラウン	4617509F