ラット脳からの神経血管ユニットの分離法

要約

出典:Brzica、H.、et al,.新たに単離されたラット脳の微小血管から膜サンプルを調製するためのシンプルで再現性の高い方法。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、安楽死させたラットから脳の微小血管を分離するプロセスを示しています。これには、脳の解剖、組織の洗浄、機械的消化、その後の遠心分離の繰り返しによる微小血管の純粋な画分を分離することが含まれます。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。プロトコルの手続きフローを図 1 に示します。

1. プロシージャのセットアップ

1. 脳微小血管緩衝液(BMB)を調製します。まず、54.66 gのD-マンニトール、1.90 g EGTA(エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸)、および1.46 g 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール(すなわち、トリス)ベースをきれいなビーカーに計量します。1.0Lの脱イオン水を加えます。マグネチックスターラーを使用してBMBバッファーの成分を混合します。溶液を完全に混合したら、1.0 M HClを使用してpHを7.4に調整します。
2. 動物に麻酔をかける前に、26%デキストラン(MW 75,000)溶液(w / v)を準備します。.次の手順に従って、デキストラン溶液を準備します。
   手記： デキストランが水性緩衝液に溶解するのに約1.5〜2時間かかる可能性があるため、この溶液を事前に調製することが非常に重要です。
   1. 粉末デキストラン(緩衝液100 mLあたり26 g)を清潔なビーカーに入れます。
   2. BMBの適切な量を測定し、別の清潔なビーカーに分注します。
   3. 粉末デキストランが入ったビーカーにBMBをゆっくりと注ぎます。BMBを注ぐ間、ガラス攪拌棒を使用して粉末デキストランを手動で混合します。
   4. 使用直前に1.0 M HClでpHを7.4に調整します.
      手記： 12匹のSprague-Dawleyラット(雄または雌、生後3ヶ月、各200-250g)からの脳微小血管の典型的な単離には、200mLのデキストラン溶液(すなわち、200mLのBMBに52gのデキストラン)が必要です。

>2. Sprague-Dawleyラットからの脳組織の抽出

1. 所望の実験的治療に続いて、ケタミン(50 mg / kg; 2.5 mL / kg i.p.)とキシラジン(10 mg / mL; 2.5 mL / kg I、p.)を使用してSprague-Dawleyラットを麻酔します。.ケタミンとキシラジンを0.9%生理食塩水で希釈し、それぞれ最終濃度20 mg/mLと4.0 mg/mLにします。IACUC(Institutional Animal Care & Use Committee)のガイドラインに従って、鋭利なギロチンを使用して斬首することにより動物を安楽死させます。雄と雌の両方のSprague-Dawleyラットに同じ手順を使用してください。
2. 手術用ハサミを使用して横方向に1回切開することにより、ラットの頭蓋骨から皮膚を切除します。
3. ロンゲールを使用して、頭蓋骨プレートを慎重に取り外し、脳を露出させます。
4. へらを使って脳を取り出します。大脳を剥離し、分離された脳組織を5mLのBMBを含む50mLの円錐管に入れます。使用直前に、BMBバッファー1.0 mLあたり1.0 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。

3. 脳の処理

1. 50mLの円錐形チューブから脳組織を清潔なシャーレに移します。
2. 鉗子を使って、直径12.5cmの濾紙の上で脳をやさしく転がし、大脳皮質にゆるく付着している外側の髄膜を取り除きます。脳組織を濾紙にそっと押し付け、組織を再度転がします。この手順では、濾紙を頻繁に回します。
3. 鉗子を使用して脈絡叢を大脳半球から分離します.
   手記：脈絡叢は、脳室の表面に局在する透明な膜組織として現れます。
4. 脳組織をやさしく平らにし、鉗子を使用して残りの髄膜と嗅球を取り除きます。
5. 皮質脳組織を冷やしたガラス乳鉢に入れます。5.0 mLのBMB含有プロテアーゼ阻害剤カクテルを乳鉢に加えます。.
6. オーバーヘッドパワーホモジナイザーを使用して、3,700rpmで15回の上下ストロークを使用して脳組織を均質化します。10 mLの乳鉢と乳棒ティッシュグラインダーを使用して均質化を行います。個々のサンプルの均質化の間に、70%エタノールを使用して乳棒を洗浄します.
   手記：均質化ストロークは、ペースと大きさの点で一貫している必要があります。
7. ホモジネートを標識された遠心分離管に注ぎます。

4. 遠心分離の手順

1. 8.0 mLの26%デキストラン溶液を、脳ホモジネートを含む各標識遠心チューブに加えます。
2. チューブを2回反転させてから、サンプルを完全にボルテックスします。複数の角度を使用して各サンプルのボルテックスを行い、脳内ホモジネート溶液と26%デキストラン溶液が完全に混合されるようにします。
3. サンプルを5,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します
   手記：一部の解析では、脳の微小血管と脳実質を比較することが有用です。脳実質におけるタンパク質発現の評価が必要な場合は、この遠心分離ステップからの上清(すなわち、脳実質画分)を収集し、将来の使用のために-80°Cで保存することができます。
4. 真空吸引器とガラス製パスツールピペットを使用して上清を取り除きます.
   手記：ペレットを邪魔しないように注意する必要があります。そうしないと、採取される脳の微小血管の量が減少し、この手順によるタンパク質収量が大幅に減少します。
5. ペレットを5.0 mLのBMB含有プロテアーゼ阻害剤カクテル(すなわち、BMBバッファー1.0 mLあたり1.0 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル)に再懸濁します。ペレットをボルテックスして、完全に混合します。
6. このプロトコルのステップ4.1-4.2で説明されているように、8.0 mLの26%デキストランを各遠心分離チューブとボルテックスに加えます。
7. サンプルを5,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
8. 真空フラスコとガラスピペットを使用して、上清を吸引し、脳の微小血管を含むペレットが破壊されないようにします。
   手記：チューブ壁に付着した余分な材料には微小血管が含まれていないため、慎重に清掃して取り除く必要があります。
9. 手順 4.5 から 4.8 をさらに 2 回繰り返します。
10. デキストランの遠心分離ステップを4回行ったら、各ペレットとボルテックスに5.0 mLのBMBを添加してサンプルを再懸濁します
    手記： ステップ4.10の完了後、タンパク質の局在を分析するために、マイクロベッセル全体を収集できます。これは、再懸濁した微小血管ペレットの50μLアリコートを採取し、ガラス顕微鏡スライドに塗ることで達成できます。次に、マイクロベッセルを加熱ブロック上で95°Cで10分間熱固定し、続いて氷冷エタノールでさらに10分間固定します。その後、スライドはイメージング研究に必要になるまで4°Cで保存できます。

結果

図 1: ラット脳微小血管の単離と膜サンプルの調製の手順とプロトコルの概要

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ・アルドリッチ	#P8340	脳微小血管バッファーの成分
D-マンニトール	シグマ・アルドリッチ	#M4125	脳微小血管バッファーの成分
エグタ	シグマ・アルドリッチ	#E3889	脳微小血管バッファーの成分
トリズマベース	シグマ・アルドリッチ	#T1503	脳微小血管バッファーの成分
デキストラン (MW 75,000)	スペクトラムケミカルMftg株式会社	#DE125	脳実質から微小血管を分離するための遠心分離ステップで使用されるデキストランは
ゼタミン	MWIアニマルヘルス	#501072	全身麻酔薬
キシラジン	西洋医療用品	#5530	全身麻酔薬
0.9%生理食塩水	西洋医療用品	該当なし	全身麻酔薬希釈液
濾紙(直径12.5cm)	VWRの	#28320から100	脳組織からの髄膜の除去に使用されます
遠心分離管	ザルシュテット	#60.540.386	デキストラン遠心分離ステップに使用される使い捨てチューブ
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) アッセイ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	#23236	メンブレン調製物中のタンパク質濃度の測定
ウィートンオーバーヘッドパワーホモジナイザー	DWKライフサイエンス	#903475	サンプルの均質化に必要
10.0mlガラス乳鉢と乳棒ティッシュグラインダー	DWKライフサイエンス	#358039	サンプルの均質化に必要
塩酸	シグマ・アルドリッチ	#H1758	バッファーのpH調整に必要
標準鉗子	ファインサイエンスツール	#91100から12	脳組織の解剖に使用
フリードマン・ピアソン・ロンガーズ	ファインサイエンスツール	#16020から14	脳を隔離するために頭蓋骨を開くために使用されます
50 mL コニカル遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	#352070	単離後の脳組織の採取に使用
ガラスパスツールピペット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	#13-678-20C	デキストランスピン後の細胞デブリの吸引に使用
エタノール、無水	シグマ・アルドリッチ	#459836	ティッシュグラインダーの洗浄に使用、蒸留水で70%に希釈
ケタミン
アイスバケツ