ヒト神経幹細胞からの皮質錐体ニューロンの生成

要約

出典:Gouder, L., et al,.ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起スパインの三次元定量化。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、神経幹細胞の接着と成長を促進するために、ポリオルニチンとラミニンでコーティングされたガラスカバースリップを準備する方法を説明しています。この手法には、シーケンシャルインキュベーションと洗浄が含まれ、ニューロンに見られる構造を模倣して、ニューロン細胞の成長と分化を促進する支持マトリックスの形成を促進します。

プロトコル

1. Neuronal Culture
   手記：多能性幹細胞における線維芽細胞のリプログラミング、背側終脳系譜への関与、後期皮質前駆細胞(LCP)の誘導、増幅、およびバンク化がBoissartらに記述されています。LCP様細胞のニューロン分化も、Boissartらに従ってわずかな変更を加えて行われました。他の手順は、線維芽細胞を人工多能性幹細胞に直接再プログラミングし、続いてニューロンに分化させるためのものとして開発されています。このプロトコルは、錐体型グルタミン酸作動性ニューロンの選択的な産生を可能にするため、保持されました。
   1. ガラスカバースリップで6ウェル培養プレートをポリオルニチン(DPBS(Dulbecco s Phosphate Buffered Saline)で1/6に希釈、ストック濃度0.01%)O/Nで処理し、続いてDPBSで3回洗浄します。次に、ラミニン(ストック濃度1 mg / ml、DPBSで500倍に希釈)をフローフードの下に少なくとも10時間加えます。
   2. DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12(500 ml)、N2サプリメント2バイアル(各5 ml)、B27サプリメント2バイアル(各10 ml)、ペンストレプトマイシン10 ml(ペニシリン=10,000ユニット/mL、ストレプトマイシン=10,000ユニット/mL)からなる3 mLの培養液に、ガラスカバースリップ付きの6ウェル培養プレートで低密度(50,000細胞/cm²)でNSCをプレート化し、ディスパッチします。 2-メルカプトエタノール(原液:50 mM)およびラミニン(1/500)1 ml(成長因子なし)。重要なステップ:この手順は、ゆっくりと回転する動きの細胞を追加して、細胞のクラスタリングを減らすことにより、慎重に実行します。
   3. 培地を取り出します。2 μg/mlの新鮮なラミニン溶液を含む新しいN2B27培地を添加して、ニューロンをガラスカバースリップに付着させ、凝集を防ぎます。媒体は3日ごとに交換してください。細胞が乾燥するのを防ぐために、新しい培地を追加する前に、残りの培地(200μl)の一部を保持してください。または、急速に進行し、総量(3 ml)を変更します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PD-PBS(1X)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	ギブコ/ライフテクノロジーズ	14190169
ポリ-L-オルニチン溶液バイオ試薬	シグマ・アルドリッチ	P4957
マウスラミニン	ダッチャー・ドミニク	354232
N2サプリメント	ギブコ/ライフテクノロジーズ	17502048
B-27 増補 w/無 vit A (50X)	ギブコ/ライフテクノロジーズ	12587010
DMEM /ナット。MIX F-12 グルートI	ギブコ/ライフテクノロジーズ	31331028
ニューロベースメディカルSFM	ギブコ/ライフテクノロジーズ	21103049
2-メルカプトエタノール	ギブコ/ライフテクノロジーズ	〒31350-010
ペン-ステプトマイシン	ギブコ/ライフテクノロジーズ	15140-122
カバーガラス 13 mm	VWRの	〒631-0150
プロロングゴールド退色防止試薬avec DAPI	ギブコ/ライフテクノロジーズ	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, 粘性液体	シグマ・アルドリッチ・チミー	P7949
ヒト線維芽細胞	Coriell Cell Line バイオレポジトリ	GM 4603 および GM 1869	コリエル医学研究所、カムデン、ニュージャージー州、米国
CO2インキュベーター
6ウェル培養プレート
ピプテット