マウスの子犬の脳からの視床皮質スライスの調製

要約

>出典: Slater, B. J., et al., Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、マウスの子犬の脳から視床皮質脳スライスの準備を示しています。孤立した脳は、マークされたスライド上に整列し、聴中脳と前脳を同じ平面に整列させるために斜めにカットされます。次に、ビブラトームを使用して脳をスライスし、主要な聴覚中脳と前脳の構造を含むスライスを保持チャンバーに移して保存します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. スライスのためのマウスからの脳の準備と除去

1. 灌流とスライスのインキュベーションを準備します。
   1. スライスの約30分前に、記録またはイメージングする前に、スライスのインキュベーション用に高ショ糖切断溶液と低カルシウム人工脳脊髄液(aCSF)を調製します。
   2. 灌流とスライスに必要なすべてのツール(大きな鈍い端のはさみ、小さなスプリングはさみ、解剖学的鉗子、大きなはさみまたはギロチン、虹彩はさみ、宝石商の鉗子、27G x 1/2インチの針が付いた10 ml注射器、1 cm x 2 cmの濾紙の小片、スライス転写用の壊れた先端のパスツールピペット)をレイアウトします。 灌流トレイを準備します。
   3. 32^°Cの水浴と切断溶液で満たされた培養皿に酸素化aCSFのインキュベーションチャンバーを設置します。
2. スライス用のカッティングステージを準備します。
   1. 3%寒天の小片を約^1cm3にカットして脳のバックストップとして使用し、1.5 cm x 1.5 mm x 3mmで下丘(IC)を支えるために使用するバンプに使用します。
   2. バックストップをシアノアクリレート接着剤でステージに接着し、バックストップの右側にあるバンプを80^°の角度になるように
   接着します。
3. 脳を取り除きます。
   1. 出生後12日目から出生後20日目(p12-p20、理想的にはp14-18)マウスにケタミン100 mg / kgおよびキシラキシン3 mg / kg(または同等の倫理委員会が承認した手順)で深く麻酔します
      手記：つま先をつまむことに反応しないことで、適切な麻酔レベルを確認します。動物は短時間麻酔下にあるため、眼科用軟膏は不要です。
   2. 鈍い端のはさみを使用して、剣状突起から胸郭を首に露出させます。
      1. 剣状突起を見つけ、約1.5cmの水平カットを行います。
      2. 前の水平カットの端から肩まで、それぞれ約1.5cmの2つの垂直カットを行います。
   3. 横隔膜と肋軟骨接合部を切断して心臓を露出させます。
   4. 小さなスプリングハサミで、心臓の腹側から背側にかけて、右心房に2〜5mmの小さな切り込みを入れます。
   5. 27G x 1/2インチの針が付いた10mlの注射器を使用して、左心室を注入し、動物に高ショ糖切断溶液を迅速に灌流します。
   6. 血液がきれいになったら、大きなハサミを使って頭を取り除きます
      手記：灌流の有用性を体系的に評価してこなかった。しかし、私たちの経験では、この若いマウスの経心臓灌流はほぼ100%の成功で行うことができ、蛍光を発してイメージングを妨げる可能性のある赤血球を排除するという利点があります。
   7. 頭蓋骨を露出させるために、皮膚を正中線の下に切り取ります。
   8. 曲がった虹彩ハサミを使用して、目の間の頭蓋骨を切断し、次に目の間の切断から始めて、正中線縫合糸に沿って前方から後方に慎重に切断します。
      手記：硬膜は通常、頭蓋骨と一緒に剥がれます。必要に応じて、脳を慎重に取り除く前に硬膜を取り除きます。
   9. 宝石商の鉗子を使用して、頭蓋骨をこじ開け、脳を慎重に取り出してから、脳を切断液に入れます。皮質を傷つけないように注意してください。

2. スライスのための脳の準備

1. ビブラトームステージにマウントするための脳の準備。
   1. 左上から右下へ90^°の2本の線と17^°の対角線でマークされたスライドを使用して、2本の線が交わる場所で交差し、脳の背側を上にして置き、かみそりの刃を使用して、吻側脳の2〜4mmを取り除き、平らな面を作成します。
   2. 新しく作成した平らな面に脳の尾側を上にして置き、脳の背側を水平に、脳の正中線を垂直線に合わせます。
   3. かみそりの刃を17^°のラインに合わせ、かみそりを30^°の角度で傾け、右皮質の約3 mmを二重の斜めのカット(水平面から17^°、冠状静脈から60^°)で取り外します。
2. ビブラトームステージに脳をマウント。
   1. 脳の腹側に1 cm x 2 cmの小さな濾紙を置き、長辺が正中線に対して垂直
   になるようにします。
   2. バックストップの前の領域(およびバンプの左側)に少量のシアノアクリレート接着剤を慎重に塗布します。
   3. 斜めにカットされた二重の脳の面を接着剤に置き、脳と後脳の尾側が隆起に支えられ、脳の右側がバックストップに当たるようにします。
   4. 脳を繊細に押し下げ、表面全体がスライスチャンバーに接触していることを確認します。

3. 視床皮質スライスの取得

1. すぐに切断ステージを取り、ビブラトームに配置し、ステージを切断液で満たします。
2. ブレードを脳の上部(腹側)に合わせます。
3. 脳の上部から1〜1.5 mmを取り外し、300〜500 μmのスライスを取り外し、除去後の深さを評価します。
   注:IC、内側膝状体(MGB)、外側膝状核(LGN)がすべて見え、歯状回が「C」字型になっている場合は、600μmのスライスを1〜2枚取ります。図 1A を参照してください。
4. スライスを加熱された(32^°C)保持チャンバーに入れます。

結果

図 1.colliculo-thalamocortical brain sliceのFlavoprotein自家蛍光イメージング。(A)フラビンタンパク質自家蛍光によって確認された接続された視床-視床皮質脳スライス。0.05Hzでの電気刺激、4Hzで画像化されたICおよびフーリエは、刺激周波数でパワーを示すように処理されました。MGB、視床網様体核(TRN)、聴覚皮質(AC)、線条体(CS)の活性化に注意してください。 (B)未接続スライス。MGBの活性化のみによるICの電気刺激。(C) 非定型的なACの活性化 MGBまたはTRNに可視信号がないACの活性化を伴うICの電気刺激。経路はおそらく無傷ですが、MGBの活性細胞は組織の反対側にある可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高ショ糖切削ソリューション			mM:206スクロース、10.0 MgCl2、11.0グルコース、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、0.5 CaCl2、2.5 KCl、pH 7.4
低カルシウムaCSF			mM:126 NaCl、3.0 MgCl2、10.0グルコース、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、1.0 CaCl2、2.5 KCl、pH 7.4
aCSFの			mM:126 NaCl、2.0 MgCl2、10.0グルコース、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、2.0 CaCl2、2.5 KCl、pH 7.4
DMSOの	ライフテクノロジー	D12345	ロット:1572C502
大きな文化料理	フィッシャーブランド	08-757-13	100x15mm培養皿
小さな文化料理	隼	353001	35x10mm培養皿
隆起した培養膜	ミリセル	PICMORG50	スライスの両側で酸素化された液体の灌流を維持するために使用されます。
脳をブロックするための寒天			3重量%の水