方法論記事

人工ヒト誘導多能性幹細胞からの神経筋接合部のin vitro誘導

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Lin, C. et al., In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp.(2020年)。

この実験では、ヒトが誘導した多能性幹細胞から神経筋接合部を生成する方法を詳しく説明しています。段階的な分化プロセスを使用して、筋管ニューロンと運動ニューロンの発達とシナプス形成を促進し、機能的な神経筋接合をもたらします。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞外マトリックス(ECM)コーティングプレートの作製

  1. ECM(材料表を参照)を氷冷した1x PBSで最終濃度2%まで希釈
    2. します
  2. 50 mLのプラスチックチューブに1x PBSの49 mLにECM1 mLを加えます。ピペッティングを数回上下させてよく混ぜます。
  3. カバースリップを1枚、6ウェルプレートの各ウェルに入れます。各ウェルに1.5 mLの2% ECMを加えます。
  4. ウェルプレートを2% ECMと共に37°Cで2時間インキュベー
    5. トします。
  5. ウェルプレートからECMを吸引し、プレートを4°Cで保存してから使用してください。

2. iPS細胞のNMJへの差別化

  1. セクション1で調製した6ウェルプレート上のウェルあたり4 x 105個のiPSCをシードします。ウェルに事前に堆積したカバーガラスに細胞を播種してください.
    手記：本研究では、201B7MYOD iPS細胞株を使用しました。
    1. 6 cm培養皿のiPS細胞から培地を取り出し、1x PBSでiPS細胞を一度洗浄します。
    2. 1 mLの細胞剥離溶液を皿に加え、37°Cで10分間インキュベー
      3. トします。
    3. 3 mLの霊長類胚性幹(ES)細胞培地を皿に加え、3回静かにピペット
      4. で移します。
    4. 分離したiPS細胞を含む上清を50 mLのプラスチックチューブに集め、160 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
    5. 上清を慎重に吸引し、iPS細胞を10 μM Y27632を含む3 mLの霊長類ES細胞培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントします。
    6. iPS細胞を霊長類ES細胞培地と10μM Y27632で2 x 105細胞/mLの濃度に希釈します。セクション1で説明したウェルにあらかじめ堆積させたカバーガラスに2 mLのiPS細胞を加えます。

3. iPS細胞のNMJへの誘導

  1. 1日目、iPS細胞を6ウェルプレートに播種してから24時間後に、培地を取り出し、1 μg/mLのドキシサイクリンを含む2 mLの新鮮な霊長類ES細胞培地と各ウェルに交換します。
  2. 各ウェルに1 μg/mLのドキシサイクリン(最終濃度)を含む2 mLの筋原性分化培地(MDM)(表1)で培地を交換します。2日目から10日目まで毎日ミディアムをリフレッシュしてください。
  3. 11日目から、培地を2 mLのNMJ培地(表1)に各ウェルに切り替えます。その後、30日目まで3〜3日ごとにメディアを更新します。
  4. 30日目に位相反転顕微鏡で分化したNMJを観察します。NMJは、以下の分析に用いることができます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>表1:媒体の式。

筋原性分化培地(MDM)MEM-アルファ500mL
100mM 2-ME1117μL
ドキシサイクリン1μg/mL
KSRの56mL(最終10%)
ペン/連鎖球菌2.5mL
トー...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
中成長因子および試薬
2-メルカプトエタノールナカライ・テスク21418から42
B27、ギブコギブコ〒12587-001
BDNFのR&Dシステム248-BDの
細胞剥離液「Accumax」STEMCELLテクノロジー#07921
臨界点乾燥機日立ES-2030
ドキシサイクリンタカラ631311
ECM、マトリゲル(成長因子低下)コーニング356230
GDNFのR&Dシステム212-GD
ゲル化、IPゲルジェノスタッフPG20-1
イオンコーター日本電子JEC3000FC
iPS細胞用メディア、mTeSRSTEMCELLテクノロジー85850
ノックアウトSR(KSR)ギブコ〒10828-028
生細胞顕微鏡検査ニコンエクリプスTi顕微鏡
MEM-アルファギブコ12571-071
N2、ギブコギブコ17502-048
神経基礎媒体ギブコ21103-049
NT3R&Dシステム267-N3
霊長類ES細胞培地リプロセルRCHEMD001
SEMの日立S-4700
TEM日立H7650-J
27632円ワコーケミカルズGmbH〒253-00513
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タグ

Human iPSCsMYOD InductionMyotube FormationMotor Neuron DifferentiationNeuromuscular JunctionDoxycycline TreatmentROCK InhibitorECM CoatingCell DifferentiationSynapse Formation

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