神経細胞培養のための背根神経節の採取と解離の技術

要約

出典:de Luca, A. C., et al., 背根神経節ニューロンと分化脂肪由来幹細胞:末梢神経再生を研究するためのIn Vitro共培養モデル。

このビデオは、後根神経節(DRG)からニューロンを採取する方法を示しています。ラットの脊柱からDRGを単離し、酵素で処理した後、機械的に解離して単一細胞懸濁液を得る。ニューロンは、密度勾配遠心分離を使用してグリア細胞から分離され、増殖培地で培養されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 実験的な設定

1. 組織と細胞の採取を開始する前に、すべてのツールが無菌であることを確認してください。必要に応じて、鋭利な手術用ハサミ、非常に細かい鉗子、および細い標準鉗子のペアをオートクレーブします。また、必要に応じて、細胞播種前にUV滅菌、エタノール曝露、または蒸気滅菌を使用して各基質を滅菌します。
2. ニューロンの採取と解離のための培地およびストック溶液の調製
   1. Bottenstein and Sato's (BS) 培地を調製し、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) と 1% N2 サプリメントを Ham's F12 培地に加えます。必要な最終容量をウェルあたり500 μlとして計算します(24ウェルプレートを使用している場合)。
   2. コラゲナーゼIVストックをハムのF12培地に1.25 wt/vの濃度で調製し、溶液をフィルター滅菌し、-20°Cで200 μlアリコートとして保存します。
   3. ハムのF12培地に2.5 wt/vの濃度でウシ膵臓トリプシンストックを調製し、フィルター滅菌して-20 °Cで200 μlアリコートとして保存します。
   4. F12培地中のフィルター滅菌済み1 mg/ml脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(BSA)溶液に5 μg/mLの濃度の神経成長因子(NGF)ストック溶液を調製し、200 μlアリコートとして-20°Cで保存します。再構成後にNGFをフィルタリングしないでください。
3. 表面改質が行われていない場合は、ポリ-D-リジン(室温[RT]で0.1 mg / mlで15分間)および/またはラミニン(37°Cで2時間2-10 μg / cm²)でカバースリップ/プレートをコーティングして、ニューロンの付着と神経突起伸長を適切にサポートします。.
4. 使用する前に、必ず37°Cのウォーターバスでメディアをウォームアップしてください。

2. 後根神経節(DRG)ニューロンの収穫と解離

1. 子宮頸部脱臼と斬首によってラットを終了します。ラットを剃り、皮膚を持ち上げて脊柱を露出させます。鋭利なハサミを使用して、限られた臓器や血管に特別な注意を払いながら脊柱を切除します。ペトリ皿を使用して生物学的安全キャビネット(クラスII)に脊柱を移し、背側部分をすべて取り除きます。
2. 脊柱を縦軸に沿って半分に分割し、滅菌済みの鋭利な手術用ハサミを使用して、臍帯組織を露出させます。この時点で、脊柱を胸郭のレベルより下の2つの小さなセグメントに切断すると、DRGニューロンの採取中に扱いやすくなります。細い鉗子を使用して、DRGの根を引っ張って取り除かないように注意しながら、すべての臍帯組織をそっと取り除きます。このようにして、DRGと根は脊柱に包まれたまま、脊柱内に露出します。DRGは、運河から直接出ている白いフィラメントとして観察します。
3. 非常に細い鉗子を使用して、脊柱管の奥深くまで入り、神経節の根を傷つけないように注意しながら、脊柱管からDRG根全体(DRGだけでなく)を引き出します。DRGを、1%PSを添加した3〜4mlのハムF12培地を含む小さなシャーレ(60mm²)に移します。異なる動物を使用する場合は、別々の皿を使用してください。
4. 解剖顕微鏡下で、グリア細胞の汚染を減らすために、滅菌鉗子とメスを使用して、神経節を取り巻く過剰な神経根のDRGを洗浄します。DRGを35 mm 2 mmの新鮮なF12培地を入れた小さなシャーレ(1.8 mm²)に移します。
5. 1.25% wt/v コラゲナーゼIV型ストック溶液200 μl(最終濃度0.125%)を添加し、DRGを37°C、5% CO₂で1時間インキュベートします。DRGを吸引したり損傷したりしないように注意しながら、ガラスピペットで培地を慎重に吸引します。0.125 wt/v コラゲナーゼ IV 型酵素を添加した新鮮な F12 培地を添加し、前述のように 1 時間インキュベートします。
6. メディウムを吸引し、DRGをF12メディウムで優しく洗います。次に、1.8 mLのF12培地と200 μlのトリプシン(最終濃度0.25% wt/v)を加え、37 °C、5% CO₂で30分間インキュベートします。
7. トリプシンを除去し、500 μlのウシ胎児血清(FBS)を添加したF12培地1 mLを加えて、酵素反応を停止します。培地を吸引し、DRGをF12培地で3回優しく洗浄して、血清の痕跡を取り除きます。
8. 2 mLの新鮮なF12培地を加え、ガラスピペットを使用して、培地とDRGを15 mLチューブに慎重に移します。ガラスピペットでピペッティング(約8〜10回)することにより、DRGニューロンを穏やかに解離します(プラスチック製の先端を代わりに使用できます)。
9. ペレットをチューブの底に沈殿させ、培地を新しいチューブに集めます。ペレットの入ったチューブに2 mLの新鮮なF12培地を加え、ガラスピペットで機械的解離を繰り返します。懸濁液が均一になるまで(約3〜4回)この手順を繰り返し、解離したすべてのDRGを新しいチューブに集めます。この方法は、機械的解離から生じるストレスを軽減し、ニューロンの生存率を向上させます。
10. 得られた均質化された懸濁液を100 μmのセルストレーナーを使用して新しい15 mLチューブにろ過し、解離していないニューロンやその他の破片を取り除きます。この段階では、最初に細胞懸濁液を50 mLのチューブにろ過し、次にガラスピペットを使用して溶液を小さい方のチューブに移すと便利な場合があります。懸濁液を110gで5分間遠心分離します。
11. 500 μlのF12培地に500 μlの30% BSA溶液を加えて、15% BSAを調製します。溶液を15 mLチューブの壁にゆっくりとピペットで流し込み、緩やかなタンパク質の軌跡を作ります。この段階では、チューブを45°の角度で保持し、ファルコンチューブの番号を「トラック」の形成の基準として使用してBSAをゆっくりと解放すると便利です。
12. ステップ2.10で上清を吸引し、チューブの底に500 μlを残し、細胞ペレットを同じ培地に再懸濁します。ステップ2.11で以前に調製したタンパク質のトレームに沿って懸濁液をゆっくりとピペットで動かし(チューブの数字を参考にして)、500gで5分間遠心分離します。
13. 上清を吸引し、ペレットを1mlの改質BS培地に再懸濁します.
    手記： DRGニューロンを再懸濁する容量は、必要な最終細胞濃度と播種するサンプルの数に応じて、実際に必要な容量まで作成できます。1匹の動物が24ウェルプレート実験に十分な細胞を提供します。
14. 播種したサンプルを37°C、5%CO₂で2時間インキュベートして細胞接着を可能にし、最後に50 ng/mlのNGFを添加した新鮮なBS培地を加えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 μmセルストレーナー	BDバイオサイエンス	352360	70 μm ストレーナー (Ref. 352350) を代用可能
15 mLプラスチックチューブ	ザルシュテット	62.554.002
50 mLプラスチックチューブ	ザルシュテット	62.547.004
75 cm2フラスコ	コーニング	BC301
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	A9205の
コラゲナーゼIV型	ワージントン生化学	LS004188	注:このコラゲナーゼは、DRG外植片を解離するためにのみ使用されます
ウシ胎児血清(FBS)	バイオセラ	FB-1001
ガラスピペット	フィッシャーサイエンティフィック	FB50253	それに応じて廃棄される鋭利な材料
ニュートリエントミックス F12 HAM	シグマ	N6658	指定のない限り、水浴で37°Cで温めます
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	シグマ	H9394-J	指定のない限り、水浴で37°Cで温めます
N-2サプリメント(100x)	インビトゲン	17502
神経成長因子2.5sタンパク質、マウス顎下腺(NGF)	ミリポア	NC011
ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)	シグマ	P0781
ペトリ皿	コーニング	430165
トリプシン(2xウシ膵臓)	ワージントン生化学	LS003703	これはDRGの解離に使用されます

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