一過性DMSO治療による幹細胞分化の促進

要約

出典: Sambo, D. et al., Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、G1期の細胞を停止させる一過性DMSO処理で幹細胞の分化を促進する方法を実演しています。治療後、BMPおよびTGF-β阻害剤を含む外胚葉分化培地を添加して、神経前駆体の形成を促進します。

プロトコル

1. 幹細胞の維持

>注:以下に説明する細胞維持プロトコルは、接着性単分子膜で維持される多能性幹細胞(PSC)に適用されます。ジメチルスルホキシド(DMSO)処理前に使用した培地、その他の試薬、および細胞培養プレートは、必要に応じて調整できます。この原稿の以下のすべてのプロトコルについて、細胞は生物学的安全キャビネットの下で取り扱う必要があります。

1. 無菌の6ウェル組織培養処理プレートに、製造元の指示に従って調製した多能性幹細胞認定マトリックスまたは基質をコーティングし、CO₂インキュベーター(5%CO₂、湿潤雰囲気)で少なくとも1時間インキュベートします。コーティングされたプレートはフィルムで包まれ、4°Cで最大1週間保存できます。
2. 凍結保存されたPSCを37°Cのウォーターバスで解凍します。生物学的安全キャビネットに導入する前にバイアルをエタノールで滅菌し、その後すぐに5〜10容量の予熱幹細胞培地を含む滅菌円錐管にピペッティングして細胞を移します。
3. 細胞を300 x gで室温(RT)で5分間遠心分離します。
4. 培地を吸引し、Y-27632などの10 μM rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を添加した幹細胞培地1 mLに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。
5. プレートから培養マトリックスを吸引し、所望の密度、通常はウェルあたり0.5〜10⁶個の細胞で、ウェルあたり少なくとも2 mLの幹細胞培地に細胞を播種します。
   手記： めっき密度は、細胞株やクローンによって異なる可能性があるため、それに応じて最適化する必要があります。
6. 予熱した幹細胞培地と毎日交換して、細胞を維持します。約70%〜80%のコンフルエント度で、または細胞コロニーが接触し始めたときに細胞を分割します。
7. 細胞を分裂させるには、培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄します。細胞をウェルあたり1 mLの解離酵素溶液と37°Cで5〜10分間インキュベー
トします。
8. 予め温めた幹細胞培地で細胞を洗浄して再懸濁し、5〜10容量の幹細胞培地を入れた滅菌コニカルチューブに移します。手順1.3〜1.7に従って、セルをプレートします。

2. DMSO前処理

>注:分化前のDMSO前処理のために細胞をプレーティングする場合、幹細胞株の典型的な増殖速度と使用される分化プロトコルを考慮して、開始プレーティング細胞密度を最適化する必要があります。必要に応じて、従来のマーカーを使用して多能性を検証します。細胞は、分化前に最初の解凍後少なくとも1x-2xで継代する必要があります。

1. 2Dカルチャーの分化
   1. 細胞が適切なコンフルエントに達したら、コーティングされたプレートを調製し、細胞を解離し、上記のように単一細胞懸濁液を調製します。
   2. 血球計算盤またはトリパンブルーまたは別の生存率マーカーを含む自動セルカウンターを使用して、生細胞をカウントします。
   3. 幹細胞培地中の0.5-1 x 10⁶細胞/ウェルでコーティングされた6ウェルプレートに細胞を10μMのROCK阻害剤で播種します。
      注:私たちの研究室で試験した細胞株では、これらの密度は通常、24時間DMSO前処理内で80%〜90%のコンフルエント細胞をもたらしました。
   4. 細胞を_CO2インキュベーター(5%CO₂、湿潤雰囲気)で37°Cで24時間インキュベートします。
   5. 予熱した幹細胞培地に1%-2% DMSOを調製します(例:10 mLの培地に100 μLのDMSO=1% DMSO溶液、または10 mLの培地に200 μL DMSO=2% DMSO溶液)。
   6. 24時間のインキュベーション後、細胞から培地を吸引し、DMSO溶液で置き換えます。
   7. 分化する前に、細胞を_CO2インキュベーター(5%CO₂、湿潤雰囲気)で37°Cで24時間から48時間インキュベートします。
      注:通常、24時間のDMSO処理は、ヒト胚性および人工多能性幹細胞(ESCおよびiPSC)株の大部分で十分です。増殖速度が非常に遅い(倍加時間が長い)細胞株は、DMSOによる48時間インキュベーションの恩恵を受けることができます。DMSOによる48時間のインキュベーションの場合、最初の24時間の処理後に、培地を1%〜2%DMSOの新鮮な幹細胞培地と交換できます。

3. 一次細菌層への分化

>注:以下は、6ウェルプレート上の単層で成長したPSCに対して、私たちの研究室で以前に効果的であることが示された方法を説明しています。選択した分化プロトコルは、DMSO処理後に使用して、目的の系統への分化を促進する必要があります。24-48時間処理後にDMSO溶液を取り出し、標準プロトコルに従って分化を進めます。

1. 外胚葉の分化
   1. 2D培養のために、上記のように細胞をDMSOで前処理します。
   2. NogginとSB431542ストック溶液を準備します。
   3. ノックアウトダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)にノックアウト血清補充薬(KOSR)を最終濃度10%に溶解することにより、外胚葉分化ベース培地を調製します
      手記： 3 日から 4 日間のメディア交換に十分な基本メディアを準備します。
   4. Nogginを最終濃度500 ng/mLまで添加し、最終濃度10 μMまでSB431542して、予熱したKOSR/ノックアウトDMEMを適切な量にすることで、外胚葉分化培地を調製します。
   5. DMSO前処理後、細胞から培地を吸引し、分化培地(例:6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)と交換します。
   6. CO₂インキュベーター(5% CO₂、湿潤雰囲気)で細胞を37°Cで3〜4日間インキュベートし、毎日培地を新たに添加した分化因子と交換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート	コーニング	353046
Countess II FL 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AMQAF1000
DMEM/F-12	ギブコ	11320033
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
ノックアウトDMEM	ギブコ	10829018
ノックアウトセラム交換	ギブコ	10828028
マトリゲル基底膜マトリックス	コーニング	354277
ノギンFCキメラプロテイン	R&Dシステム	3344-NG-050
SB431542	ステムジェント	04-0010
超低付着マイクロプレート	コーニング	3471
Y-27632	StemCellテクノロジー	72302

名