成体ラットの脊髄脳室周囲領域からの神経幹前駆細胞の単離

要約

出典:Mothe, A., et al., Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、成体ラットの脊髄の脳室周囲組織から神経幹/前駆細胞を単離する方法を紹介しています。この技術には、タンパク質分解酵素を含む溶液中で組織断片をインキュベートして細胞外マトリックスを破壊し、細胞を放出することが含まれます。その後、放出された細胞は、神経幹/前駆細胞の増殖を促進し、三次元神経圏への凝集を促進する特定の成長因子を含む培地に播種されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 解剖バッファーと培養培地の準備

1. ラット脊髄の単離のために、100mlの解剖緩衝液(1x PBS + 0.6%グルコース+ 2%ペニシリン - ストレプトマイシン)を調製し、冷蔵する。
2. 100 mLの無血清培地(SFM)を調製し、37°Cで温めます。SFMを調製するには、2 mM L-グルタミン、100 μg/mlペニシリン-ストレプトマイシン、2% B27、および10%ホルモンミックスをNeurobasal-A培地に加えます。ホルモンミックスを調製するには、0.6% グルコース、3 mM NaHCO₃、5 mM HEPES、25 μg/ml インスリン、100 μg/ml アポトランスフェリン、10 μM プトレシン、30 nM セレン、および 20 nM プロゲステロンを含む 1:1 DMEM/F12 培地を調製します。
3. EFH成長因子を豊富に含んだめっき培地を調製し(SFMに20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、および2 μg/mlヘパリンを添加)、37°Cで温めます。

>2. 成体ラット脳室周囲脊髄組織の採取と解剖

1. 解剖器具をエタノールで滅菌し、滅菌生理食塩水またはオートクレーブ器具で事前にすすいでください。ラット(6〜8週齢)に致死量の注射をします ペントバルビタールナトリウム (65 mg / mlで1 cc)または麻酔薬の過剰摂取 (すなわち、.、4%イソフルラン)施設が承認した動物のプロトコルに従って。.ラットの背中に70%エタノールを浸し、大きな解剖ハサミで背側の皮膚を取り除きます。
2. ハサミを背側に対して垂直に保持し、後肢の上の脊柱を横方向に切ります。小さなハサミを使用して、脊柱の上にある背筋を吻側方向に縦方向に切断し、棘突起を露出させます。
3. 露出した尾側の端から始めて、ロンジャーまたは小さな鈍い骨切断器具を、脊髄と脊柱の間の空間にある脊柱管の外側側面に硬膜外に挿入します。椎弓板(椎骨の両側にある棘突起の左右の骨弓)に小さな切り込みを入れ、椎弓を慎重に剥がして脊髄を露出させます(図1A-D)。ブレードの角度が浅く、コードと平行になっていることを確認して、下にある脊髄が損傷しないようにします。
4. 吻側方向に椎弓切除術を続けて、胸部と頸部の脊髄を露出させます。
5. 鈍い組織鉗子で脊柱から脊髄をそっと切除し、マイクロハサミを使用して根を慎重に切断してコードを解放します。切除した脊髄を、4°Cの滅菌ラット解剖緩衝液(上記1.1で説明)を含むシャーレに入れます。新たに調製した4°Cの解剖緩衝液で組織をすすぎ、ハサミを使用して脊髄を横方向に1cmのセグメントに切断します(図1E)。
6. 組織の各セグメントについて、片手を使って細い鉗子で組織を保持します。一方、マイクロハサミを使用して、解剖スコープを使用して、上にある髄膜、白質、および灰白質の大部分を慎重に取り除きます。あるいは、細い鉗子(Dumont #4)を使用して灰白質の大部分を剥がし、上衣と周囲の少量の灰白質を含む脊髄の脳室周囲領域のみを残します(図1F-H)。
7. 解剖した脳室周囲組織を、冷たいラット解剖緩衝液を含む10cmの滅菌ペトリ皿にプールします。

3. 成体ラット脊髄NSPCの単離と培養

1. 次の手順を層流フードで無菌的に実行します。
   1. 解剖したラットの脳室周囲組織をマイクロハサミで1mmに細かく刻みます。
   2. 材料/試薬の表に示されているように、パパイン解離キットを使用して、ミンチ組織をタンパク質分解酵素と酵素的に解離します
      手記： 試薬成分には、バイアル1:アール平衡塩溶液(EBSS)の4つのバイアルが含まれています。バイアル2:L-システインとEDTAを含むパパイン。バイアル3:デオキシリボヌクレアーゼI(DNase)。バイアル4:ウシ血清アルブミン(BSA)を含むオボムコイドプロテアーゼ阻害剤.
      注:パパインは、タンパク質基質に対して幅広い特異性を持つスルフヒドリルプロテアーゼです。本明細書中のパパインは、カリカパパイヤ植物のラテックスに由来し、膵臓プロテアーゼよりも広範囲にほとんどのタンパク質基質を分解する。解離プロセス中に、DNAが解離培地に放出される原因となる細胞損傷があり、粘度が上昇し、ピペッティングが困難になります。したがって、DNaseは、無傷の細胞を損傷することなくDNAを消化するための細胞単離手順に含まれています。オボムコイドは、解離ステップ後のパパイン活性を阻害するために使用される糖タンパク質プロテアーゼ阻害剤です。
2. 初回使用時には、アルブミンオボムコイド阻害剤混合物(バイアル4)を32mlのEBSS(バイアル1)で再構成し、その後4°Cで保存してその後の単離に使用します。手記： これにより、1 mLあたり10 mgのオボムコイド阻害剤と10 mgのアルブミンの有効濃度の溶液が得られます。
3. 5 mLのEBSS(バイアル1)をパパインバイアル(バイアル2)に加え、1 mM L-システインと0.5 mM EDTA中の20ユニットのパパイン/mLの溶液が得られます。完全に溶解したときにパパイン溶液が透明に見えることを確認してください。.それ以外の場合は、パパインが完全に溶解するまでバイアルを37°Cの水浴に10分間置き、酵素の総活性を確保します。
4. 500 μlのEBSS (バイアル1) をDNaseバイアル (バイアル3) に加え、DNaseがせん断変性に敏感であるため、穏やかに混合します。パパインバイアルに250 μlのDNase溶液を添加すると、最終濃度は約20ユニット/mlのパパインと0.005%DNaseになります。残りの DNAse は、後で使用するために保存しておきましょう。
5. ミンチしたラット組織をパパイン溶液に入れます。.
6. ロッカープラットフォーム上で絶えず攪拌しながら37°Cでインキュベートし、活性化パパイン溶液中の組織を解離します。ラット組織を45分から1時間インキュベートします。
7. 10 mLのピペットで混合物を粉砕し、残っている組織片を解離して、曇った細胞懸濁液を生成します。細胞懸濁液(未解離組織の片片は含まない)を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、300 x gでRTで5分間遠心分離します。
8. ペレット化した細胞を、パパイン阻害剤であるオボムコイドを含む培地に再懸濁します。
   1. 15 mLのコニカルチューブに、2.7 mLのEBSS(バイアル1)と再構成したアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液(バイアル4)300 μlを混合して、オボムコイド溶液を調製します。DNase溶液(バイアル3)150μlを加えます。
   2. ペレット化した細胞から上清を捨て、直ちに細胞ペレットを希釈したDNaseアルブミン-阻害剤混合物に再懸濁します。
無
9. 傷の細胞を細胞膜から分離し、1ステップの不連続な密度勾配による遠心分離を行います。
   1. 15 mLのチューブに5 mLのアルブミン阻害剤溶液(バイアル4)を添加し、5 mLのピペットを使用して、アルブミン阻害剤溶液の上に細胞懸濁液(上記のように調製)を穏やかかつゆっくりと重ねて、不連続密度勾配を調製します。
   2. 70 x gで6分間、RT.
      で遠心分離します。 手記：グラジエントの2つのレイヤー間の界面ははっきりと見えるはずですが、この境界での最小限の混合は結果に影響を与えません。膜断片は界面に残り、解離した細胞はチューブの底にペレット
   状になります。
10. 上清を捨て、細胞ペレットをラットEFH培地1 mL(37°Cで予熱)に再懸濁します。血球計算盤で生細胞密度をカウントし、EFHで10細胞/μlの密度で細胞をT25培養フラスコにプレートします。ラット組織からの細胞の典型的な収量は、約2×10⁶細胞であり、約80%の生存率を有する。クローン培養が必要な場合は、10細胞/μl未満の密度で細胞を播種します。フラスコを5%_CO2で37°Cでインキュベートし、球体の凝集を避けるために培養物を1週間邪魔されずに成長させます。

結果

図 1.ラット脊髄の椎弓切除術と脳室周囲領域の解剖。(A)脊髄の露出した尾側端で、ロンジャーは脊柱管の外側側面に硬膜外に挿入されます。(B)椎骨の両側の椎弓板に小さな切り込みを入れ、椎弓を慎重に剥がして脊髄を露出させます。(C)椎弓切除術後の露出した頸髄。(D)脊髄と椎弓切除術のために作られた切開の位置を示す胸椎断面の概略図(赤い点線で描かれています)。椎弓板と棘突起(影付きの領域)が除去されます。(E)脊髄を横方向に1cmのセグメントに切断します。(F)上にある髄膜、白質、および灰白質の大部分は、マイクロハサミを使用して慎重に除去されます。(g)ミンチした脳室...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBSの	ライフテクノロジー	#10010023	解剖バッファー
1x HBSSの	ライフテクノロジー	#14175095	解剖バッファー
D-グルコース	シグマ	#G-6152	解剖バッファーとホルモンミックス用の30%グルコースストック溶液を調製します
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	#15140から148	解剖バッファーと培地
ニューロバサル-A	ライフテクノロジー	#10888-022	培地
L-グルタミン、200 mM	ライフテクノロジー	#25030-081	培地
B27	ライフテクノロジー	#12587010	培地
DMEM	ライフテクノロジー	#11885084	ホルモンミックス
F12	ライフテクノロジー	#21700-075	ホルモンミックス
NaHCO3	シグマ	#S-5761	ホルモンミックス用の7.5%NaHCO3ストック溶液を調製
ヘープス	シグマ	#H9136	ホルモンミックス用の1M HEPESストック溶液を調製
インスリン	シグマ	#I-5500	ホルモンミックス
アポトランスフェリン	シグマ	#T-2252	ホルモンミックス
プトレシン	シグマ	#P7505	ホルモンミックス
セレン	シグマ	#S-9133	ホルモンミックス
プロゲステロン	シグマ	#P-6149	ホルモンミックス
EGF、マウス	シグマ	#E4127	B27で100μg/mlのストックを調製し、分注します。EFHミディアム
bFGF、ヒト組換え体	シグマ	#F0291	B27で100μg/mlのストックを調製し、分注します。EFHミディアム
ヘパリン、10,000 U	シグマ	#H3149	ホルモンミックスと分注で27.3 mg / mlのストックを準備します。EFHミディアム
パパイン解離キット	ワージントンバイオケミカルズ	#LK003150	EBSS、パパイン、DNase、オボムコイドプロテアーゼ阻害剤とBSAを含有
ペントバルビタールナトリウム	ビメダ – MTC Animal Health Inc	DINの00141704
組織鉗子:アジソン	ファインサイエンスツール	#11006から12	鋸歯状の標準チップ、マイクロチップも用意
ファインフォーセプス:デュモン#4	ファインサイエンスツール	#11241から30
マイクロハサミ	ファインサイエンスツール	#15024から10	丸型ハンドルのバンナ
ロンゲール	ボシュロム	N1430
10mmシャーレ	ヌンク	1501
T25カルチャーフラスコ	ヌンク	156367
6ウェルプレート	ヌンク	CA73520-906