マウス脳周皮細胞の単離と培養

要約

出典:Mehra, A., et al., A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、マウスの脳から脳周皮細胞を分離する方法を示しています。単離した細胞は、ペリサイト特異的培地で培養され、ペリサイト増殖を促進します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 溶液の準備

1. 500 mLの洗浄バッファーA(WBA)を調製します:ハンク平衡塩溶液(HBSS)中の10 mM HEPES溶液。4°Cで保存してください。
2. 500 mLの洗浄バッファーB(WBB)を調製します:0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)とHBSS中の10 mM HEPES溶液。4°Cで保存してください。
3. WBA中の30%デキストラン溶液300mLを室温で一晩混合して調製します。使用前に溶液を110°Cで30分間オートクレーブします。オートクレーブ後、溶液を室温で2〜3時間休ませます。溶液は4°Cで保存します。
4. 0.1% BSA溶液100 mLを冷たいデキストラン溶液で調製します。3〜4分間激しく振とうし、4°Cで保存します。
5. 20%ウシ血清、2 mMグルタミン、50 μg/mLゲンタマイシン、1%ビタミン、2%アミノ酸Basal Medium Eagle(BME)をBasal DMEM培地に溶解し、4°Cで保存し、完全なDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培地を調製し、使用前に1 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加します。
6. 周産細胞培養基礎培地に周産増殖サプリメント(周産培地に付属)と20%ウシ胎児血清(FCS)を添加して、完全な周産培地を調製し、4°Cで保存します。

>2. 脳組織の回復と髄膜の除去

1. 一貫性を保つために、抽出のすべてのバッチで同様の年齢および性別のマウスを使用します。病原体のない動物保護施設を利用し、水への自由なアクセスを提供します。動物の効率を確保し、使用を最小限に抑えるために、組織材料の損失を避けてください。
2. C57BL/6J、4-6週齢、雄マウスを安楽死させます(Janvier labs、Le Genest-Saint-Isle、フランス)。
3. 無菌状態で脳組織を迅速に切除し、組織への損傷を避けます。組織を40 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に慎重に置きます。
4. 冷たくなったPBS中の脳組織をシャーレ(100 mm x 15 mm)に移します。
5. 脳組織を滅菌済みの乾燥した糸くずの出ないワイプに置き、湾曲した先端鉗子で小脳、線条体、後頭神経を取り除きます。
   1. 綿棒で目に見える髄膜をすべて取り除きます。脳組織を逆さまに置き、外側に軽いストロークを使用して綿棒で葉を開きます。目に見える血管をすべて取り除きます。
   2. 髄膜遊離脳組織を、15 mLの冷たしWBBを含むシャーレ(100 mm x 15 mm)に入れます。.

3. 均質化

1. 組織をDounceティッシュグラインダーモルタルチューブに移し、鉗子で3〜4mLのWBBを追加します。
2. 「ゆるい」乳棒でティッシュを55回ミンチにします。「緩い」乳棒をWBBですすいでください。次に、「きつい」乳棒でスラリーを25回ミンチします。
3. スラリーを2本の50mLチューブに均等に分け、1.5倍の量の冷たい30%BSA-デキストランを加え、チューブを激しく振ってスラリーを混合します。

4. 血管画分の分離

1. チューブを激しく振とうした後、チューブを3,000 x g、4°Cで25分間遠心分離します。
2. 上清(および上部ミエリン層)を2つの新しいチューブに移し、チューブを3,000 x gおよび4°Cで25分間遠心分離します。3 mLの冷WBBを加えて、最初の遠心分離からのペレットを保存します(ペレットを4°Cに保ちます)。
3. ステップ4.2を繰り返し、2回目の遠心分離で得たペレットを慎重に保存します。
4. ステップ4.3のチューブからデキストランとミエリンを組織破片と一緒に廃棄します。.ペレットを冷たいWBBで保存します。
5. ステップ 4.1 のチューブ 1 とチューブ 2 の内容物をプールし、冷たい WBB で最終容量 10 mL まで作ります。
6. ステップ4.2とステップ4.3.
   のチューブに対してこの手順を繰り返します 注:最後に、3つの遠心分離機から3つのチューブがあります。
7. 10 mLピペットを使用して6回の上下ストロークでペレットを解離し、目に見えるペレットの塊がなくなるまで解離します。
8. 真空フィルターアセンブリとナイロンメッシュフィルターを使用して、各チューブの細胞懸濁液をろ過します.
   手記：このろ過ステップは、メッシュフィルターを介して長い/より大きな容器を除去するために重要です。
9. フラットチップ鉗子またはWBBのスクレーパーを使用してフィルターを室温で掻き取り、毛細血管を回復して再懸濁します。新しいフィルターで懸濁液をろ過して、より多くの毛細血管を回復します
10. 濾液を均等に2本のチューブに分け、1,000 x gおよびRT.
    で7分間遠心分離します。 注:この遠心分離ステップでは、酵素溶液を調製します。使用する動物の数に応じて、必要なWBBの量を決定します(材料の表を参照)。1x の DNase 1 と 1x の Tosyl-L-lysyl-chloromethane 塩酸塩 (TLCK) (材料表を参照) を WBB に添加し、37 °C に予温します。
11. ステップ4.10のペレットを、酵素を含む予め加温したWBBを含む1本のチューブに集めます。予め温めた1xコラゲナーゼ/ディスパーゼを加えます。チューブを37°Cのシェーキングテーブルウォーターバスに正確に33分間置きます。
12. 冷たいWBB30mLを加えて酵素反応を停止します。懸濁液を1,000 x gおよびRTで7分間遠心分離します。
13. 上清を慎重に捨て、10 mLピペットを使用して6回の上下ストロークでペレットをWBBで解離します。この手順は、厳密さを抑え、比較的高速にする必要があります。
14. 懸濁液を1,000 x gおよびRT.
    で7分間遠心分離します 注:このステップでは、培養皿からコーティングを廃棄し、室温でDMEMで一度すすいでください。細胞培養皿をRTで少なくとも1時間コーティングします。
15. ステップ4.14で得られたチューブから上清を捨て、ペレットを新しい完全なDMEM培地で解離し、細胞を6ウェルプレートの9ウェル(各9.6cm2の1ウェル)にプレートします(0日目、P0)。

>5. 脳周皮細胞の増殖

1. 無菌インキュベーターで細胞培養物を37°Cおよび5%CO₂に維持します。細胞を播種してから24時間後(1日目)に、破片を慎重に取り除き、培地を交換してください。1日目以降、48時間ごとに培地を交換します。
2. 細胞培養を少なくとも7〜8日間観察します。この時までに、内皮単層の頂上での細胞増殖が観察可能になるはずです。
3. 8〜10日目(コンフルエンシーによる)に細胞を周皮培養培地でゼラチン被覆培養プレート上の1(P1)に継代します。培養液は2日ごとに交換してください。細胞を6〜7日間観察します。細胞を17日目に継代2(P2)に再度連続して分割し[必要に応じて24日目に継代3(P3)]し、ゼラチン被覆プレートの周皮細胞培地で増殖させます
   手記： 細胞は、ほぼ80〜90%の密度で実験/観察の準備ができている必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミノ酸BME	シグマ	病棟6766	4°Cで保存してください。
基礎DMEM培地	インビトゲン	316000083	4°Cで保存してください。
基本的な線維芽細胞成長因子	シグマ	F-0291	-20°Cで保存してください。
BSAの	シグマ	A-8412	4°Cで保存してください。
コラゲナーゼ分散酵素	シグマ	10269638001	滅菌PBS-CMF中の10倍ストック溶液を調製します。0.22 μmシリンジフィルターで溶液をろ過し、-20 °Cで保存します。注:プロトコールの酵素消化ステップでは、抽出用のマウス10匹のセットごとに、300 μLの10xコラゲナーゼディスパーゼが必要です。
デキストラン	シグマ	31398
DNase I	シグマ	11284932001	1000 mgを10 mLの滅菌水に溶解して1000倍ストック溶液を調製し、-20°Cで保存します。
ゼラチン	シグマ	G-2500	滅菌PBS-CMF(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O)、pH 7.4)中に0.2%ゼラチン溶液を調製して、ワーキングコーティングを調製します。溶液を120°Cで最低20分間オートクレーブし、室温で保存します。培養皿は、4°Cで少なくとも4時間コーティングする必要があります。
ゲンタマイシン	バイオクロムAG	A-2712 (日本語版	4°Cで保存してください。
グルタミン	メルク	I.00289	-20°Cで保存してください。
HBSSの	シグマ	H-8264	4°Cで保存してください。
ヘープス	シグマ	H-0887	4°Cで保存してください。
マトリゲル	BDバイオコート	354230	マトリゲルの作業コーティング溶液を調製するには、ストックを冷DMEMで1:48の比率で希釈し、最終濃度を85μg/cm2とします。細胞培養皿は、室温で少なくとも1時間コーティングする必要があります。
ペリサイトミディアムマウス	理学研究室	1231	4°Cで保存してください。
トシルリシンクロロメチルケトン	シグマ	T-7254	1000倍WBA原液を調製するには、16 mgを10.88 mLのWBAに溶解して4 mM溶液を調製し、4°Cで保存します。
ビタミン	シグマ	B-6891	-20°Cで保存してください。
ろ過ツール	セファール、ナイロンメッシュ、60ミクロンの気孔率
実験装置	スイングバケットローター遠心分離機
攪拌機付きウォーターバス
層流フード:BSL2
ガラス製品(すべての部品を加熱滅菌)	ガラス乳棒付きディスンスティッシュグラインダー
乳棒I:0.0035-0.0065インチ
乳棒II:0.0010 - 0.0030インチ
粗い気孔率フリットガラスフィルターサポートベースを備えた真空フィルターアセンブリ