マウス海馬組織からの単一細胞懸濁液の取得

要約

出典:Trujillo, M., et al. Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、自動化された機械的解離と酵素の混合物を組み合わせて酵素消化を助けることにより、マウスの脳海馬から生存率の高い単一細胞懸濁液を得るためのプロトコルを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 各サンプルにEnzyme Mix 1と2を準備し

ます

>注:2 mLを超える容量の場合は10 mLの血清学的ピペットを使用します。容量が200 μL-2 mLの場合は1000 μLのピペットを使用します。容量が21〜199 μLの場合は200 μLのピペットを使用します。容量が2〜20 μLの場合は20 μLのピペットを使用します。2 μL未満の容量の場合は0〜2 μLのピペットを使用します。

1. 各サンプルについて、Enzyme PとEnzyme Aをそれぞれ1アリコートずつ室温で解凍します。
2. Enzyme mix 1の場合、標識されたCチューブに50 μLのEnzyme Pと1900 μLのBuffer Zを混ぜ合わせます(材料表)。
3. Enzyme mix 2の場合、解凍したEnzyme Aの10 μLアリコートに20 μLのBuffer Yを加えます。

2. 成人の脳解離プロトコル

>注:サンプルを扱うときは、特に断りのない限り、BSAとD-PBSを氷上に残しながら、チューブを室温でチューブラックに置く必要があります。

1. 解離器のスイッチを入れます。
2. 鉗子を使用して、海馬組織片をCチューブに移します。
3. 30 μLのEnzyme mix 2をCチューブに移します。テンションが感じられるまでキャップをひねり、カチッと音がするまで締めます。
4. Cチューブを逆さまにして解離器の位置に置くと、サンプルに「Selected」ステータスが割り当てられます(図1)。ヒーターをCチューブに固定します。
5. フォルダアイコンを押し、[お気に入り]フォルダを選択し、スクロールして37C_ABDK_02プログラムを選択します。[OK]をクリックして、選択したすべてのCチューブにプログラムを適用し、[スタート]をタップします(図1)。
6. サンプルごとに50 mLコニカルチューブ1本を標識します。
7. 各50 mLコニカルチューブに70 μmのセルストレーナーを置き、2 mLのBSAバッファーで湿らせます。
8. プログラムが完了したら、ヒーターとCチューブを解離器から取り外します。
9. 4 mLのBSAバッファーをサンプルに加え、混合物を50 mLコニカルチューブのセルストレーナーに塗布します。
10. CチューブにD-PBSを10mL加えて閉じ、溶液を穏やかに撫でます。50mLのコニカルチューブのセルストレーナーに塗布します。
11. セルストレーナーとCチューブを廃棄します。懸濁液を300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。次に、上清を吸引して廃棄します。

3. がれきの除去

1. ペレットを1550 μLの冷D-PBSで再懸濁し、懸濁液を標識された15 mLコニカルチューブに移します。
2. 450 μLの冷たい破片除去溶液を加え、ピペットを上下に動かします(ボルテックスしないでください)
   手記：デブリ除去ソリューションは、市販のアダルトブライアン解離キットの試薬です。
3. 1 mLの冷たいD-PBSを細胞懸濁液の上に穏やかに重ね、先端を円錐管の壁に当てます。合計オーバーレイが2 mLになるまで繰り返します
   手記：この手順は重要です。熟練度と器用さで実行します。
4. 3000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、全加速と全ブレーキで遠心分離します.
   手記：フェーズが明確に分離されていない場合は、手順7.2〜7.3を繰り返します。最後に1000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
5. これで、サスペンションは3つの異なる層で構成されている必要があります(図2)。最上層を吸引します。ピペットの先端を前後にスイープして、白い中間層を吸引します。最下層を乱さずに、中間層をできるだけ取り除きます。
   手記：この手順は重要です。熟練度と器用さで実行します。
6. 冷やしたD-PBSを2mL加え、ピペットで上下に動かして混ぜます。
7. 1000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、全加速と全ブレーキで遠心分離します。上清を吸引して捨てます。ペレットを1 mLのBSAバッファーに再懸濁します.
   注:細胞を適切なバッファーに再懸濁し、磁気標識して、この時点でのシングルセルシーケンシングに備えることができます。

結果

図1:ステップ2.4で選択したステータス

図2:ステップ3.5の三層懸濁液:バッファー(上層)、細胞破片、破片除去溶液、および細胞(下層)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL 微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-682-003	バシックス アソートカラー
15 mL ファルコンチューブ	Becton Dickinson Labware Europe (英語)	352009	ポリスチレン
25 mLセロロジカルピペット	フィッシャーサイエンティフィック	14-955-235
70 μmセルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィック	08-771-2
成人脳解離キット	ミルテニーバイオテック	130-107-677	酵素P、バッファーZ、バッファーY、酵素A、バッファーA、デブリ除去液を配合
BSAの	シグマ・アルドリッチ	A7906-50Gの
Falcon 50 mL コニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-432-22
ジェントルMACS Cチューブ	ミルテニーバイオテック	〒130-093-237
gentleMACS オクトディスソシエータ ヒーター付き	ミルテニーバイオテック	〒130-096-427
Gibco DPBS (1倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144
ガラスビーカー	フィッシャーサイエンティフィック	02-555-25A
ピペットチップ GP LTS 20 μL 960A/10	レイニン	30389270
ピペットチップ GP LTS 250 μL 960A/10	レイニン	30389277
ピペットチップ RT LTS 1000 μL FL 768A/8	レイニン	30389213
レイニン Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	レイニン	30386597
ふた付き丸いアイスバケツ	フィッシャーサイエンティフィック	07-210-129
セルストレーナーキャップ付き丸底チューブ	隼	〒100-0087

(代表)