マウス脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製

要約

出典:DiSano, K. D., et al. 免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連髄膜の単離。J. Vis. Exp. (2020年)。

ビデオは、マウスの脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製を示しています。これには、脳組織から細胞を放出するための酵素消化と、それに続く密度勾配遠心分離による免疫細胞の密度に基づいて単離され、単一細胞懸濁液を得るためのものが含まれます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 脳と脊髄組織の単一細胞懸濁液の調製

1. チューブから組織と培地を注ぐことにより、培地を含む脳または脊髄組織を100mmシャーレの上部に移します。鉗子を使用して、組織をペトリ皿の底に移動します。滅菌のかみそりの刃で脳または脊髄を細かく刻みます。カミソリの刃を使用して、ひき肉にした組織をこすり落としてプレートの底に移動させます。
   手記：以下の酵素消化プロトコルでは、最大2つの脊髄を一緒にプールして処理することができます。脳は個別に処理する必要があります。
2. 5 mLの血清学的ピペットを使用して、3 mLのRPMI(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(10%子牛胎児血清(FCS)を補充)をペトリ皿に加えます。10 mLの血清ピペットを使用して、ピペットを上下に動かして、メディア中の組織を再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移します><。 手記： ダウンストリームアプリケーションがシングルセルまたはバルクRNAシーケンシング解析または細胞培養である場合、FCSロットは、解析前に細胞が活性化されていないことを確認するために試験する必要があります。あるいは、10% FCSのRPMIの代わりに、0.04% BSAの1x PBSを使用して細胞を処理することもできます。
3. 10 mLの血清ピペットを使用して、ペトリ皿を追加の2 mLの培地で洗浄し、残留組織を採取し、コニカルチューブに移して合計5 mLにします。処理ステップの合間にチューブを氷の上に保ちます。
4. ピペットを使用して、コラゲナーゼI粉末をハンク平衡塩溶液(HBSS)培地に再懸濁し、目的の濃度(100 mg/mL)を得ます。コラゲナーゼI型を、ミンチ組織サンプルが入ったコニカルチューブに添加して、目的の最終濃度(すなわち、1 mg/mLで50 μL)を得ます。
   手記： コラゲナーゼの濃度が高いと、細胞収量は増加しますが、細胞表面マーカーを切断する可能性があります。したがって、コラゲナーゼIロットを滴定して、必要なすべての細胞表面マーカーをそのままにして、最大数の生存細胞を得るために必要な最適な濃度を決定する必要があります。例えば、コラゲナーゼIは、単一の脳または脊髄サンプルに対して、0.5 mg/mL、1 mg/mL、および2 mg/mLの最終濃度で試験されました。細胞生存率はトリパンブルー排除法を用いて決定し、細胞表面マーカーCD45、CD19、およびCD4をフローサイトメトリーで評価しました。1 mg/mL 濃度のコラゲナーゼ I では、目的の細胞表面マーカーをすべて保持しながら、最も高い生細胞数が得られました。したがって、この濃度は、これらの細胞タイプを調べるさらなる実験に使用されました。
5. 0.15 M塩化ナトリウムを使用してDNase I粉末を所望のストック濃度まで穏やかに再懸濁します。再懸濁したDNase Iを、ミンチ組織サンプルが入ったコニカルチューブに添加して、最終濃度20 U/mL
   を得ます。 手記：DNase Iロットは、mLあたりの活性の単位によって異なります。組織サンプルに添加される濃度は、ストックバイアルのミリリットルあたりの活性単位に基づいて変化します。サンプルあたりの最終的な所望濃度は 20 U/mL です。
6. チューブを37°Cのウォーターバスのチューブラックに入れ、40分間インキュベートします。15分ごとにチューブを反転させて、組織と酵素を完全に混合します。インキュベーション後、各チューブに500 μLの0.1 M EDTA(pH = 7.2)を加えて最終濃度を0.01 M EDTAにし、さらに5分間インキュベートしてコラゲナーゼを不活性化します。
7. 10 mLの血清ピペットを使用して、10% FCSを添加したRPMIを9 mL各チューブに加え、各チューブの容量を~14.5 mLにします。450 x gで4°Cで5分間遠心分離し、真空のパスツールピペットを使用して、細胞ペレットに触れないように注意しながら上清を吸引します。
8. 5 mLの血清ピペットを使用して、細胞ペレットを含むチューブに3 mLの100%ストック等張密度勾配溶液を加えます。10 mLの血清ピペットを使用して、RPMI 10% FCS培地を追加で追加し、最終容量を10 mLにし、細胞ペレットを再懸濁して30%ストック等張密度グラジエント溶液層を作成します。
   手記：100%ストックの等張密度グラジエント培地を事前に調製し、分注し、4°Cで最大3ヶ月間保存してください。100%ストックの等張密度勾配溶液を調製するには、密度勾配培地(材料表)を密度勾配培地希釈バッファーで希釈します。密度グラジエント培地希釈バッファー(80.0 g/L NaCl、3.0 g/L KCl、0.73 g/L Na₂HPO₄、0.20 g/L KH₂PO₄、20.0 g/L グルコース)を調製し、真空フィルターシステムを使用してろ過滅菌します。100%ストックの等張密度勾配溶液を、密度勾配希釈バッファー1部と密度勾配培地9部を混合して作製します。よく混ぜます。
9. 各チューブを反転させてよく混合してから、70%ストックの等張密度グラジエント溶液の下敷きを加えます。70% ストック等張密度グラジエント溶液 1 mL を含む 1 mL の血清ピペットをチューブの底に挿入します。1mLの溶液をゆっくりと下に敷き詰め、泡を作らないように注意してください。グラジエントを乱さないように注意しながら、血清ピペットをチューブからゆっくりと取り外します.
   手記：70%アンダーレイの場合、100%ストックの等張密度グラジエント溶液をRPMI培地を使用して70%に希釈する必要があります(つまり、7 mLの100%ストック等張密度グラジエント溶液と3 mLのRPMI培地をよく混合します)。さらに、ミエリン破片の除去や、遠心分離後のグラジエント界面での純粋なシングルセル懸濁液を得るためには、クリーンで邪魔されない70%アンダーレイを作成することが不可欠です。
10. ブレーキなしで、800 x gで4°Cで30分間遠心分離します。細胞層を乱さないように注意しながら、ミエリン破片層を含む上清をチューブ内に2〜3mLが残るまで吸引します。1 mLピペットを使用して30/70%密度勾配の間の細胞層を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。
11. 10 mLの血清ピペットを使用して、RPMI 10% FCS培地を添加し、最終容量を15 mLにします。450 x g を 4 °C で 5 分間遠心分離します.
    手記：このステップでは、必要に応じて2つのチューブからの細胞層をプールできます。2本以上のチューブをプールしないと、高密度のグラジエント培地濃度のために細胞がペレット化されません。
12. 細胞ペレットを乱さないように、上清を慎重に吸引します。血球計算盤を使用して細胞をカウントするために、細胞を適切な容量/バッファーに再懸濁します(例えば、下流の表面染色のために、単一の脊髄を250μLのFACSバッファーに再懸濁します)(図1)。
13. 1 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をフィルタートップチューブの上部に移し(材料表)、細胞をチューブの底までろ過して、残っているミエリンの破片を取り除きます。
14. トリパンブルー排除色素を使用して、それを希釈し、精度40,41のために少なくとも2つの16正方形グリッドを平均することにより、血球計算盤で細胞をカウントする。
15. 目的のシングルセル解析手法に進みます.
    手記： 様々な形態のコラゲナーゼ(すなわち、D、I型、II型、IV型)、免疫細胞、ミクログリア(図1)、アストロサイト、周皮細胞、内皮細胞49、およびニューロン50の全てを効率的に単離することができる。結果を得るために得られた有核細胞数は、滴定されたコラゲナーゼI酵素を使用して次の通りでした:全偽治療脳= 500,000〜600,000細胞;TMEV-IDD脳全体= 800,000–1,000,000細胞;全偽脊髄 = 150,000–200,000細胞;TMEV-IDD脊髄全体= 300,000–400,000。細胞数は、収集、処理の精度、およびCNS炎症が存在するかどうかによって異なります。

結果

図 1: CNS組織におけるCD45hi浸潤免疫細胞の同定。(A)偽治療(赤)またはTMEV-IDD(青)マウスの脊髄の全生細胞のうち、CD45hi浸潤免疫細胞(P1)、CD45loミクログリア(P2)、およびCD45-オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびニューロンを同定するためのゲーティング戦略。最小限のCD45hi細胞が、偽治療された脳および脊髄で検出された。(B)TMEV-IDDマウスのCD45hi浸潤免疫細胞(P1)のうち、CD19+ B細胞およびCD4+ T細胞を同定するためのゲーティング戦略。ゲーティング戦略は、脳組織と脊髄組織で同様であった。(C)偽治療マウス(赤)および慢性TMEV-IDDマウス(青)の髄膜中のCD45hi細胞(P1)を同定するためのゲーティング戦略。(D)慢性TMEV-IDDマウスの髄膜におけるCD45hi浸潤免疫細胞(P1)のうち、CD19+ B...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	37002Dの
遠心機	ベックマン・コールター	アレグラX-12R遠心分離機
コラゲナーゼI	ワージントン	LS004196
コニカルチューブ、15 mL	VWRの	〒525-1069
コニカルチューブ、50 mL	VWRの	89039-658
カバーガラス	ハウザーサイエンティフィック	5000
湾曲した鉗子	ファインサイエンスツール	11003-14
ディスポーザブルポリスチレンチューブ、14 mL	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-1B
DNase I	ワージントン	LS002139
ドライアイス	エアガス	該当なし
ダーモント #7Forceps	ファインサイエンスツール	11271-30
EDTA二ナトリウム塩二水和物	アムレスコ	0105-500グラム
エタノール、100%	任意	該当なし
フィルタートップチューブ、5 mL	VWRの	352235
固定可能な生存率染色 780	ベクトン・ディキンソン	565388
グルコース	フィッシャーケミカル	D16-500
ハンクのバルンス塩溶液(HBSS)	コーニング	21-020-履歴書
血球計算盤	アンドウィン・サイエンティフィック	02-671-51B(英語)
止血	ファインサイエンスツール	13004-14
HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080
KClの	フィッシャーケミカル	BP366-500
KH2PO4(無水)	シグマ・アルドリッチ	P5655-100G
液体窒素	エアガス	該当なし
マウスFCブロック(CD16/32)	ベクトン・ディキンソン	553141
Na2HPO4(無水)	フィッシャーケミカル	S374-500
NaCl	フィッシャーケミカル	S671-500
ニードル、25ゲージ	ベクトン・ディキンソン	305122
正常なマウス血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31881
ナイロンメッシュストレーナー	VWRの	352350
10月	さくら	4583
パラホルムアルデヒド、20%	電子顕微鏡科学	15713-S	1 x PBSを使用して4%に希釈
パスツールピペット、9インチ、プラグを抜いています	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-20C
PBSの(1x)	コーニング	21-040-履歴書
PEラット抗マウスCD4	ベクトン・ディキンソン	553730
PE-CF594 ラット抗マウスCD19	ベクトン・ディキンソン	562329
Percoll 密度グラデーションメディア	GEヘルスケア	17-0891-01
PerCP-Cy5.5ラット抗マウスCD45	ベクトン・ディキンソン	550994
ペトリ皿, 100 mm	VWRの	353003
pHメーター	フィッシャーサイエンティフィック	13-636-AB150
ピペットエイド	ドラモンド・サイエンティフィック・コーポレーション	4-000-101
ピペット 200 μl	ギルソン	FA10005M
ピペットチップ、1 mL	USAサイエンティフィック	〒1111-2831
ピペットチップ、200 μl	USAサイエンティフィック	1111-1816
ピペット、1 mL	ギルソン	FA10006M
DAPIによるProlong Diamond封入剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P36962
精製ラット抗マウスCD16 / CD32	ベクトン・ディキンソン	553141
ウサギ抗マウスCD3(SP7クローン)	アブカム	AB16669
ウサギ抗マウスラミニン	アブカム	ab11575 (英語
ラット抗マウスERT-R7	アブカム	AB51824
RPMIの1640	コーニング	10-040-CV
血清ピペット、1 mL	VWRの	357521
血清ピペット、10 mL	VWRの	357551
血清ピペット、5 mL	VWRの	357543
水酸化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S318-100
蔗糖	フィッシャーケミカル	S5-500
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14001-16
外科用ハサミ、極細	ロボズ	RS-5882
シリンジ、10 mL	ベクトン・ディキンソン	302995
シリンジ、5 mL	ベクトン・ディキンソン	309646
トリパンブルー	ギブコ	15250-061

人 の 名 年 の ) の