横方向のソフトライト照明を用いた脳オルガノイド培養の最適化技術

要約

出典:Chen, B. et al., 横方向のソフトライト照明による脳オルガノイド培養の促進。J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオでは、横方向のソフトライト照明技術を利用して、胚体の肉眼での視覚化を改善し、それによって脳オルガノイド培養中の胚体の操作と移植を容易にする様子を紹介しています。ソフトライト照明の設定、培地交換や胚様体移植の方法、脳オルガノイド発生のための胚様体内での神経分化誘導の手順を解明します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ソフトライトランプの準備(1日目)

1. A5用紙サイズで厚さ0.3〜0.5cmの透明アクリル板をご使用ください。アクリル板の表と裏に白いパッドを貼り付けます。
2. ライトがアクリルプレートの側面から入射し、平行に発射できるように、プレートの端にLED白色ライトの列を取り付けます(図1A-F、図2B).
   手記：初期のEBsの直径は約200μmから300μmであるため、クリーンベンチの蛍光灯の下では肉眼で鮮明に観察することは困難です。一方、拡散反射が強化されたため、横方向に照らされた軟光を用いてEBを鮮明に検出することができます(図2B、C)。その後の実験では、EB培養に6ウェルプレートが推奨されます。ただし、柔らかな光の視覚効果をよりよく示すために、この研究では皿の代わりに皿を使って写真やビデオを撮ることもありますので、誤解しないでください。横方向に照らされるソフトライトランプは、6ウェルプレートにも使用できます。

>2. EBの転送と中程度の交換(2-5日目)

1. 新しい6ウェル低接着プレートを調製し、各ウェルに2 mLの胚様体(EB)形成培地を加えます。
2. 1000 μL のワイドボアピペットチップ (材料表を参照) で培地と一緒に EB を取り出し、6 ウェルの低接着プレート (~100 EBs/well) に移します。
   手記：操作プロセスでは、EBを観察しやすくするために、ステップ1で説明したソフトライトランプを採用しています。他の屋内光源をオフにして、柔らかな光の視覚効果を向上させます。
3. 毎日同じ量の新鮮なEB形成培地と交換してください。セカンダリ フローを使用して EB を中央に集め、メディアを変更します。
   1. 古い培地をウェルの端までゆっくりとピペッティングして吸引します。強く吸いすぎないでください。そうしないと、EB は一緒に削除されます。次に、新しい培地を追加してEBs.
      を再懸濁します 手記：主な二次流れ(図2D)。円軌道に沿ってディッシュを回転させることにより、渦巻き流を誘導します。渦巻き流により、二次流が誘導され、中心に向けられます。EBまたはオルガノイドは、回転によって生成される二次流によりウェルの中心に収束し、その後、培地交換または胚様移植を容易に実行できます。

3. 神経誘導 (5-7日目)

1. 接着力の低い新しい6ウェルプレートを調製し、各ウェルに3 mLのニューラル誘導培地(表1)を加えます。
2. 横方向のソフトライト(手順1で説明)をオンにし、他の屋内光源をオフにします。
3. EBをニューラル誘導媒体(~100 EBs/well)を添加した6ウェルプレートに移します。新しい井戸に元の培地をできるだけ追加しないでください.
   手記：オルガノイドトランスファーの簡単なスキルを紹介します。当然のことながら、重力下では、媒体よりも比較的高密度で、再懸濁されたEBは図2Eに示す操作を適用することで徐々に沈みます。したがって、EBは便利に転送することができます。EBと比較して、遊離細胞と死細胞断片はよりゆっくりと沈むため、ほとんどの遊離細胞と死細胞断片はこの沈降法で除去できます(図2F)。
4. サンプルを37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベートします
   手記：顕微鏡下では、EBの直径は約500μmで、エッジは半透明であり、神経上皮層が形成されていることを示しています。

>表 1.ニューラル誘導媒体の組成

の の の

コンポーネント	容積
DMEM-F12	97ミリリットル
N2サプリメント	1 mL
グルタマックスサプリメント	1 mL
MEM-NEAAの	1 mL
ヘパリン	最終濃度 1 μg/mL

結果

図1:ソフトライトランプの準備 (A)電源とLEDライトはアクリル板の片側に設置しました(赤い点線のボックスに示すように)。LEDソフトライトランプの散乱波長は450-470nm、光束は1300-1800lm、演色評価数は75-85Raです(B)LED電球が正常に点灯できるかどうかを確認しました(赤い点線のボックスに示すように)。(C)アクリル板の表と裏に白いパッドを貼り付けました(赤い矢印で示しています)。(D)ソフトライトランプの全体的な外観。(E)ソフトライトランプは、通常、スケッチをコピーする際の追跡に使用されるフレームのない市販のLEDペインティングライトパッドに置き換えることもできます。LEDペインティングライトパッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2μmフィルター	NEST Biotechnology、中国	331001
1000 μL ワイドボアピペットチップ	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	9405163
6ウェル低接着プレート	NEST Biotechnology、中国	703011	EBs懸濁培養に使用されます
遠心機	エッペンドルフ(ドイツ)	5810 R	様々なタイプの遠心分離管、試薬ボトル、作業プレートの遠心分離に使用できます。
DMEM-F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	11330032
ヘパリン	Merck, ドイツ	H3149-J
グルタマックスサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	35050061
グルタマックスサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	17504044
MEM-NEAAの	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	11140050
N2サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	17502048
ソフトライトランプ	木の実	木の実	シンプルな自作のデバイス、準備については補足図2を参照してください。