培養ショウジョウバエ脳外植片における神経幹細胞の再活性化の解析

要約

出典:Naomi Keliinui, C., et al. Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、ショウジョウバエの脳神経幹細胞の静止状態からの再活性化を開始する外因性因子を特定するためのプロトコルを示しています。孵化したばかりの幼虫を解剖して脳を分離し、その後、試験ホルモンの有無にかかわらず培地で培養して、神経幹細胞の再活性化と増殖を誘導するホルモンの可能性を評価します。

プロトコル

1. 培地と道具の準備

1. ベンチと作業エリアに70%エタノールをスプレーし、乾かします。
2. 解剖ツール、鉗子、および2つのガラス製ウォッチ皿に70%エタノールをスプレーし、ベンチで乾燥させます。
3. 補充したシュナイダーの培地(SSM、表1)を作り、氷の上に置きます。
4. SSM1mLを各ガラス時計皿にピペットで入れます。
5. 滅菌チップ付きのマイクロピペットを使用して、孵化したばかりの幼虫をPBSのプレートからSSMに移し、最初のガラス時計皿に入れます。滅菌チップ付きのマイクロピペットを使用して、孵化したばかりの幼虫を2番目のガラスウォッチディッシュのSSMに移します。

2. 解剖と脳の培養

1. 幼虫がSSM付きの2番目のガラスウォッチディッシュに入ったら、鉗子と解剖顕微鏡を使用して幼虫から脳を解剖します。必要に応じて倍率を調整します。
2. 一方の鉗子を使用して口のフックをつかみ、もう一方の鉗子を使用して、体を半分までそっとつかみ、反対方向に引っ張って(図1)、幼虫を2つに分割します。
   手記：脳はマウスフックのすぐ後ろにあります。脳の周りには他の組織があるかもしれないことに注意してください。これらの組織を取り除くときは、脳に損傷を与える可能性があるため、十分に注意してください。
3. 15〜20個の脳を解剖したら、滅菌済みの12ウェル培養トレイの1ウェルにSSM1mLを加えます。解剖したばかりの脳を、マイクロピペットと滅菌チップを使用してSSMに移します(図2A)。
4. SSM培地に入れた12ウェル培養トレイのブレインを、25°Cのインキュベーターに24時間入れます(図2A)。

>表1:補足シュナイダー培地(SSM)の作り方のレシピ。この表には、5 mLのSSMを調製するために必要なすべての成分の量がリストされています。

成分(開始濃度)	5mLを作るには	最終濃度
シュナイダーのショウジョウバエメディア	3.89ミリリットル
ウシ胎児血清(100%)	500μL<	10%
グルタミン(200 mM)	500μL	20 mM
ペニシリン(5000単位/mL)、ストレプトマイシン(50,000μg/mL)	100μL	1000 U/mL ペン、1 mg/mL 連鎖球菌
インスリン(10 mg / mL)	10 μL	0.02 mg/mL
グルタチオン(50 mg / mL)	5 μL	0.05 mg/mL
滅菌フードで、滅菌技術を使用して、14mLの円錐形チューブにすべての材料を一緒に追加します。使用するまで氷の上に置いてください。

結果

図1: SSM付きのガラス時計皿に入ったショウジョウバエの幼虫。鉗子は解剖のために適切に配置されています。幼虫の脳の位置(濃い灰色)は口のフックの後方(黒)にあり、どちらも幼虫の内側に示されています。

図 2: 脳の培養と免疫染色。(A)SSM1mLを含む12ウェル培養皿中の全脳。次いで、培養皿を25°Cのインキュベーターに24時間置く(B)72ウェルミニトレイに、免疫染色中に脳外植片を保持する。脳を洗浄し、10μLにセットしたP20マイクロピペットを使用して溶液を移します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 μL ピペットチップ	デンビルサイ	P2102
1000 μL ピペットチップ	デンビルサイ	P2103-Nの
1000 μL ピペッター	ギルソン	P1000
24ウェルマルチウェル培養プレート	フィッシャーサイエンティフィック	〒50-197-4477
35mmシャーレ	フィッシャーサイエンティフィック	08-757-100A(ゼロ)	グレーププレートの材料
解剖顕微鏡	ツァイス	ステミ 2000
エタノール200プルーフ(100%)、Decon Labs、1ガロンボトル	フィッシャーサイエンティフィック	2701	培養培地で24時間保持する前に幼虫を洗い流すために使用されます
ウシ胎児血清(10%)	シグマ	F4135-100ミリリットル	細胞培養培地用サプリメント。
解剖用の細い鉗子	ファインサイエンスツール	11295から20	ディセクションで使用されるフォルセプト。研ぐと最もよく機能します。
ガラス解剖皿(3ウェル)	これらは使用できなくなりました
グルタチオン	シグマ	G6013	細胞培養中の酸化保護を提供します。
孵卵器	サーモフィッシャーサイエンティフィック		温度、湿度、光の露出が実験全体でまったく同じであることを確認します。
インスリン	シグマ	I0516	実験の独立変数
層流フード			培地の分注に
L-グルタミン	シグマ	G7513	細胞培養中のサポートを提供
ペン連鎖球菌	シグマ	P4458-100ミリリットル	培養中の細胞の細菌汚染を防ぐために使用される抗生物質。
リン酸緩衝液、pH7.4	自社製	自社製	固定および染色ステップ後に脳を洗浄するために使用される溶媒
摘む	ファインサイエンスツール	10140-01	ブドウのプレートから幼虫を摘み取るために使用されます
シュナイダース培地	ライフテック	21720024	細胞の成長と増殖を助ける栄養素が含まれています
滅菌水	オートクレーブMilli-Q水 自社製		ソリューションに必要

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