免疫磁気ビーズを用いたマウス初代オリゴデンドロサイトの単離

要約

出典:Flores-Obando, R. E. et al., Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、マウスの仔から得られた神経細胞懸濁液から初代オリゴデンドロサイト細胞を磁気分離法で単離する方法を実演しています。この技術は、オリゴデンドロサイト抗原に特異的な抗体でコーティングされた磁気ビーズを採用しており、これらの細胞の選択的単離を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス脳皮質解離

1. 出生後5-7日齢のC57Bl/6Nマウスの子犬を、70%エタノールで洗浄したハサミで素早く斬首し、犠牲にします。
   手記：各調製物には、5〜6匹の新生児マウスの子犬の大脳皮質を使用しました。平均して、1つのマウス脳は1〜1.5 x 10⁶の初代オリゴデンドロサイト(Ols)を産生します。
2. 小さな解剖ハサミで頭皮の皮膚を正中線に沿って切り、引っ込めて頭蓋骨を露出させます。
頭蓋骨
3. の後ろの開口部から前頭部に向かって正中線に沿って慎重に頭蓋骨を切断し、脳の損傷を避けるためにハサミで持ち上げます。次に、頭蓋骨の後ろにある開口部を使用して、頭蓋骨の基部に沿って各眼窩に向かって切り込みます。
4. 細い鉗子を使用して皮質を中脳からそっと引き離し、7mLのB27NBMAが入った60mmの組織培養皿に移します。各脳について手順2.2から2.4を繰り返し、解剖された皮質をプールします。
5. 皮質を、5 mLの解離バッファー(B27NBMA、20-30 U/mL Papain、および2,500 U DNase I)を含む新しい60 mm組織培養皿に移します。
6. #15メスブレードを使用して皮質を約1 mm³の小片にさいの目に切り、37°C、5%二酸化炭素(CO₂)インキュベーターで20分間インキュベートします。
7. 1 mLのウシ成長血清(BGS)を加えて酵素反応を停止します。.
8. 10 mLの血清ピペットを使用して、皮質を解離培地とともに15 mLコニカルチューブに移します。.
9. 10mLの血清ピペットを使用して6〜8回ゆっくりとピペッティングし、泡を最小限に抑えるように注意しながら、脳組織の解離を穏やかに開始します。
10. 組織の塊が2〜3分間落ち着くのを待ち、上清を新しいチューブに移します。
11. 10% BGS/2500 U DNase I を含む 3 mL の B27NBMA mL を組織ペレットに加えます。
12. 5mLの血清ピペットを使用して、6〜8回ピペッティングしながら脳組織を穏やかに解離します。気泡を最小限に抑えるように注意してください。
13. ティッシュチャンクが2〜3分間落ち着くのを待ちます。
14. 上清を新しいチューブに移します。10% BGS/DNase I を含む 3 mL の B27NBMA を組織ペレットに加えます。
15. P1000ピペットチップを使用して脳組織を穏やかに解離し、培地と脳組織の混合物をピペッティングで上下させます。ステップ2.13と2.14を、大きな組織の塊がなくなるまで、または10%BGS/DNase Iを含むB27NBMAがなくなるまで、どちらか早い方まで繰り返します。気泡を最小限に抑えるように注意してください。
16. 以前の上清を含むプール細胞懸濁液。
17. 70 μmのセルストレーナーを50 mLのチューブに入れます。10 mLの血清ピペットを使用して、プールした細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーに穏やかに通過させます。
18. 10% BGS/DNase Iを含むB27NBMA 1 mLを加えて、細胞ストレーナーを洗浄します。
19. セルストレーナーを廃棄します。10% BGS/DNase I を含むB27NBMAで容量を 30 mL にします。
20. 細胞懸濁液を2本の15 mLコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を200 x gで10分間遠心分離します。
21. 細胞を空気にさらさせずに上清を取り除きます。上清は細胞の破片により濁ります。10%BGSを含むB27NBMA 3mLをペレットに加えます。
22. P1000ピペットを使用して細胞ペレットを慎重に解離します。10%BGSを含むB27NBMAで容量を15mLにします。.
23. 細胞懸濁液を新鮮な40μmの細胞ストレーナに通します。
24. BGSを10%含有するB27NBMA 1mLを加えて細胞ストレーナーを洗浄します。セルストレーナーを廃棄します。
25. 10%BGSを含むB27NBMAで容量を30mLにします。.
26. 細胞懸濁液を2 x 15 mLコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を200 x gで10分間遠心分離します。
27. 細胞を空気にさらさせずに、ほとんどの上清を取り除きます。細胞ペレットを5 mLの氷冷磁気セルソーティング(MCS)バッファーに再懸濁します。

2. 細胞数と生存率の決定

1. 1.5 mLの微量遠心チューブで100 μLの細胞懸濁液を400 μLのトリパンブルー溶液で希釈し、0.4% (w/v) で1:5の希釈を実現します。
2. 血球計算盤のチャンバーにカバーガラスを中央に置き、P10ピペットを使用して2つのチャンバーに10μLの細胞希釈液を充填し、過剰充填を避けます。溶液は毛細管現象によりカバーガラスの下を通過します。
3. 血球計算盤を顕微鏡ステージに置き、40倍の倍率で焦点を調整します.
   注:セルカウントは、5つの正方形(4つの角と1つの中央)のそれぞれにハンドヘルドカウンターを使用して記録されます。非生存細胞のみが色素を吸収して青色に見えますが、生きた健康な細胞は丸く屈折して見え、青色の色素を吸収しないため、ミリリットルあたりの生存細胞数と総細胞数を決定できます。

>3. O4⁺オリゴデンドロサイトの単離

1. 細胞懸濁液を200 x gで10分間遠心分離します。
2. 真空吸引を使用して上清を慎重に廃棄し、細胞が空気にさらされないようにします。
3. ペレットを1 x 10⁷細胞あたり90 μLのMCSバッファーに再懸濁し、続いて1 x 10⁷細胞あたり10 μLの抗O4ビーズを添加します。
4. 細胞懸濁液とビーズを15mLのコニカルチューブを指で4〜5回優しくはじいて混合します。
5. 混合物を4°Cで15分間インキュベートし、15 mLコニカルチューブを指で5分ごとに4〜5回フリックします。
6. 1 x 10⁷細胞あたり2 mLのMCSバッファーをチューブに穏やかに加えて、混合物を洗浄します。混合物を200 x gで10分間遠心分離します。
7. 細胞が空気にさらされないように、真空吸引を慎重に使用して上清を捨てます。細胞ペレットを1 x 10⁷細胞ごとに500 μLのMCSバッファーに再懸濁します。
8. マグネティックセパレータースタンドにマグネティックセパレーターを取り付けます。選択カラムをマグネティックセパレーターに取り付け、カラムの上部に40 μmセルストレーナを置きます。分離カラムの下に 2 本の 15 mL または 1 本の 50 mL コニカルチューブを配置して、流入を回収します。
9. 40 μm のセルストレーナーと分離カラムを 3 mL の MCS バッファーで事前にすすぎ、バッファーを乾燥させずにカラムに通します。
10. 細胞懸濁液とビーズの混合物を細胞ストレーナーと選択カラムに加えます。
11. 40 μmセルストレーナーを1 mLのMCSバッファーで洗浄します。
12. セルストレーナーを廃棄し、セル、ビーズ、バッファーの混合物を乾燥させずにカラムに流します。
13. 分離カラムを3 mLのMCSバッファーで3回、OL増殖培地で1回洗浄します。
14. マグネティックセパレーターから分離カラムを取り外し、15 mL のコニカルチューブにすばやく挿入し、すぐに 5 mL の OL 増殖培地を添加します。
15. カラムの上部にプランジャーを置き、標識された細胞をしっかりと押して15 mLコニカルチューブに洗い流します。
16. セクション3.
    に示すように、Trypan Blueと血球計算盤を使用して細胞数と生存率を測定するために、100 μLの細胞懸濁液を除去します。 注:80%を超える細胞生存率は、OLの培養を進めるために許容できると考えられますが、90%を超える生存率が最適です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10ml血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10J
10mlシリンジLuer-Locチップ	BD、ベクトン・ディッキンソン	309604
15mlコニカルチューブ	隼	352097
24ウェル組織培養プレート	隼	353935
40μmセルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィック	22368547
50mlコニカルチューブ	隼	352098
5mL 血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10H
60mm組織培養プレート	隼	353002
70μmセルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィック	22363548
抗O4ビーズ - 抗O4Microビーズ	ミルテニーバイオテック	〒130-094-543
オートフィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml	USAサイエンティフィック	〒6032-1101
オートフィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml	USAサイエンティフィック	〒6032-1102
B27	インビトゲン	17504-044
ウシ成長血清(BGS)	GEヘルスケアライフサイエンス	03 SH30541日
BSAの	フィッシャーサイエンティフィック	BP-1600-100
CNTF	ペプロテック	450-50
デソキシリボヌクレアーゼI(DNAse I)	ワージントン	LS002007
EDTAの	フィッシャーサイエンティフィック	S311
羽毛使い捨てメス	アンドウィン・サイエンティフィック	EF7281C
グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D16-1
グルタマックス	インビトゲン	35050から61
インスリン	インビトゲン	12585-014
磁気セパレータースタンド - MACSマルチスタンド	ミルテニーバイオテック	〒130-042-303
マグネティックセパレーター - MiniMACSセパレーター	ミルテニーバイオテック	〒130-042-302
Millex PES 0.22μmフィルターユニット	ミリポア	SLG033RS
ニューロベースミディアムA	インビトゲン	〒10888-022
パパイン	ワージントン	LS003126
Ca2+およびMg2+を含まないPBS	シグマ	D5652
DNase Iストック溶液			1. 氷で冷やしたHBSSに12,500 UデオキシリボヌクレアーゼI / mlで溶解します 2.氷上でろ過滅菌します 3. 200 μlで分注し、-20°Cで一晩凍結します 4.アリコートは-20〜-30°Cで保管します。
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+およびMg2+なし)			ポーチを1リットルの水に溶かして、培地1リットルあたり9.6グラムの粉末で1リットルの培地を生成します。2〜8°Cで保存します。
トリパンブルーソリューション	コーニング	25-900-CI
B27NBMA			487.75 mL ニューロベースルミディアム A、10 mL B27 サプリメント、1 mL プリモシン、1.25 mL グルタマックス;フィルター滅菌し、使用するまで4°Cで保管します。
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL ウシ成長血清
CNTF溶液ストック(10 μg/ml、1000X)			Peprotech(450-50)にご注文ください。メーカーの指示に従って0.1〜1 mg / mlで調製します(ロットごとに異なる場合があります)バッファー(例:DPBS + 0.2%BSA)。-80°C. で保存 作業溶液(10 μg/ml、1000X) 1. DPBSの解決およびろ過sterilize. で0.2% BSA(フィッシャー科学BP-1600-100)で作ります 2. マスターストックアリコートを滅菌済みで 10μg/ml に希釈し、0.2% BSA/DPBS. 3. アリコート(20μl/チューブ)を液体窒素で急速凍結します. 4. アリコートは-80°Cで保存します。
磁気セルソーティング(MCS)バッファ			リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5 mM EDTA、5μg/mlインスリン、1 g/Lグルコースを含む溶液を調製します。バッファーを0.22 μmのMillexフィルターに通してろ過することにより、滅菌および脱気します。使用するまでバッファーを4°Cで保管してください
ハンクのバランス塩(HBSS)(シグマ			1.シリンダー内の900mlの水(温度15-20°C)を測定し、穏やかにかき混ぜます. 2.力を加え、溶けるまでかき混ぜます. 3.元のパッケージを少量の水ですすいで、粉末のすべての痕跡を取り除きます. 4. 手順 2. のソリューションに追加します。 5.最終容積1リットルあたり0.35グラムの重炭酸ナトリウム(7.5%w / v)を追加します。 6.溶けるまで攪拌し続けます. 7.攪拌しながら緩衝液のpHをpH = 7.4より0.1〜0.3単位下に調整します。pH. を調整するために、1N HClまたは1N NaOHの使用をお勧めします。 8.水を追加して、最終容量を1L. にします 9.気孔率0.22ミクロンのメンブレンを使用したろ過により滅菌します. 10. 2〜8°Cで保存します。