シュワン細胞表現型を研究するためのマイクロパターン基質の調製

要約

出典: Xu, Z., Orkwis, et al. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、細胞の表現型仕様を研究するためのマイクロパターン基質の調製について説明しています。タンパク質被覆マイクロパターンPDMSスタンプは、PDMS被覆カバースリップ上のマイクロパターンを転写するために使用されます。次に、カバーガラスを界面活性剤で処理して、不要な表面での細胞接着を防ぎます。次に、細胞を添加してパターンに沈殿させ、さらなる分析のためにインキュベートします。

プロトコル

1. チューナブルな細胞培養基質の調製と特性評価

1. 基材調製
   1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースのエラストマーと硬化剤をピペットチップを使用して、10:1〜60:1の比率で激しく混合し、気泡が混合物内に均一に分散するまで混合します。気泡が消えるまで真空乾燥を使用して気泡を取り除きます.
      注:PDMS重合中、硬化剤はベースエラストマーと架橋して、最終的なポリマーの望ましい機械的特性を提供します。架橋比を調整して、PDMSの剛性を変更することができます。
   2. 乾燥させたPDMS混合物を正方形または円形のカバーガラス(22 mm x 22 mmなど)に一滴(~0.2 mL)置き、スピンコーターでカバーガラスを2500 rpmで30秒間回転させます。
   3. カバーガラスを60°Cのオーブンで1〜2時間インキュベートするか、室温で一晩インキュベートしてPDMSが固化させます。
   4. カバーガラスをUV-オゾンクリーナーで7分間(UV波長:185nm、254nm)処理し、表面の親水性を高めます。滅菌した6ウェルプレートに入れます。
   5. 細胞培養に使用する前に、基質を70%エタノールで少なくとも30分間インキュベートしてください
      注意: UV-オゾンクリーナーは、人体に有害なオゾンを生成する可能性があります。化学薬品のヒュームフード内または何らかの形の換気で作業します。
2. マイクロパターン基板調製
   1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、目的の形状およびセル接着領域(900 μm²、1,600 μm²、および2,500 μm²)を描画します。商用サプライヤーからのこれらのパターンに基づいてクロームフォトマスクを作成します。
   2. クリーンルームやほこりのない環境で、標準的なフォトリソグラフィー技術を使用してシリコンウェーハを作製します。この特定のアプリケーションの重要なパラメータは次のとおりです:フォトレジスト:SU-8 2010;フォトレジストを分散させるためのスピンプロファイル:500 rpmで10秒間、加速度100 rpm/s、次に3500 rpmで30秒間、加速度300 rpm/s;紫外線の露光エネルギー:130mJ/cm2.
      注:シリコンウェーハ上のパターンの高さは、これらのパラメータに従うと約10μmになります。長方形または三角形のパターンの外側のエッジの周りの潜在的な亀裂は、ステップ1.2.2の後に光学顕微鏡を使用して確認できます。シリコンウェーハを190°Cで30分間ベーキングすると、クラックをなくすことができます。
   3. パターン化されたシリコンウェーハを直径150 mm x 高さ15 mmの円形のシャーレ内に置き、ステップ1.1.1で準備した脱ガスPDMS(混合比10:1)をシリコンウェーハに注ぎます
      注意: マイクロコンタクト印刷ステップ中の取り扱いを容易にするために、PDMSの厚さが少なくとも5 mmであることを確認してください。
   4. シリコンウェーハ上のPDMSを60°Cのオーブンで一晩固化します。PDMSを室温まで冷まします。シリコンウェーハから正しいパターンを含む30 mm x 30 mmの正方形のスタンプを外科用メスを使用して正確にカットします。シリコンウェーハを傷つけないでください.
      注:この時点でシリコンウェーハを何度も再利用して、イソプロパノールによる洗浄後により多くのスタンプを生成できます。
   5. PDMSスタンプとチューナブルカバースリップ(ステップ1.1.1〜1.1.3で調製)を70%エタノールに30分間浸して滅菌します。
   6. マイクロコンタクト印刷後のPDMSスタンプによるマイクロパターンの有効性を確認するには、ろ過されたエアストリームとピペット50μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)(テキサスレッドコンジュゲート)溶液を使用してPDMSスタンプの表面を乾燥させ、PDMSスタンプのパターン面全体を覆います。
   7. PDMSスタンプをBSA溶液と室温で1時間インキュベートし、タンパク質の吸着を可能にします。
   8. ろ過された空気流を使用して調整可能なカバースリップの表面を乾燥させ、ステップ1.1.5で説明されているように表面の親水性を高めます。
   9. PDMSスタンプを風乾させて、残りのBSA溶液を取り除きます。
      注意: BSA溶液がスタンプから完全に除去されていることに注意してください 残りの溶液は、マイクロコンタクト印刷中にカバーガラス上でスタンプを滑らせる原因となります。
   10. スタンプのパターン化された面をチューナブルカバースリップとコンフォーマルに接触させて、カバースリップ表面にBSAを吸着します。スタンプをカバースリップにそっと押し付けて5分間
       注意: stamp 曲がってstampとカバースリップの間に非特異的な接触を引き起こすため、stamp に過度の力を加えないでください。スタンプに適切な力を加えることは、マイクロコンタクト印刷を成功させるために不可欠です。
   11. 蛍光顕微鏡とFITC(フルオレセインイソチオシアネート)フィルターを使用してマイクロパターンを調べます。
   12. 蛍光パターンではなく細胞接着領域を印刷するには、BSAタンパク質をラミニンに置き換え、手順1.2.5から1.2.10を繰り返します。
   13. カバースリップからスタンプをはがし、カバースリップを滅菌した6ウェルプレートに移します。0.2% w/v Pluronic F-127溶液を2 mLを各ウェルに加え、カバーガラスの表面を覆い、室温で1時間インキュベートします
       注:プルロニックF-127はPDMS表面に吸着することができ、PDMS表面の疎水性を高めて細胞の接着をブロックします。
   14. プルロニックF-127溶液を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5回、細胞培養培地で1回洗浄してから細胞を播種します。SCの一般的な播種密度は1,000細胞/cm²です。
   15. 細胞播種後45分で、細胞培養培地を取り出し、複数のSCが同じパターンに付着するのを防ぐために、カバースリップをPBS 2xで洗浄します。定量する前に、細胞を目的の細胞培養環境に48時間保持します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清(BSA)由来アルブミン、テキサスレッドコンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A23017 (英語)	マイクロパターンを示すためのBSA染色
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965092	細胞培養培地
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16000044	細胞培養培地サプリメント
フィブロネクチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	33010-018	カバースリップのコーティングに使用されるタンパク質
蛍光顕微鏡	ニコン	エクリプスTi2	蛍光顕微鏡
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017015	カバースリップのコーティングに使用されるタンパク質
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	細胞培養培地サプリメント
プルロニックF-127	シグマ・アルドリッチ	ピー 2443	非特異的タンパク質の結合をブロック
SYLGARD 184 PDMSベースおよび硬化剤	シグマ・アルドリッチ	761036	カバースリップのコーティングに使用されるチューナブルポリマー
UV-オゾンクリーナー	ノバスカン		PDMSの水質性の向上