マウス脊髄根からのシュワン細胞の単離

要約

出典: He, Q., et al., & Ding, F. Purification of fibroblasts and schwann cells from sensory and motor nerves in vitro. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、マウスの脊髄根からのシュワン細胞の単離と培養について概説しています。その後、単離された細胞を特定の培地で培養します。シュワン細胞は、分裂的消化と接着によって単離されます。その後、細胞外マトリックスでコーティングされたカバースリップに移され、付着と増殖が行われます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 運動神経・感覚神経線維芽細胞とSC(シュワン細胞)の単離と培養

1. 中国南通大学実験動物センターの生後7日齢のSprague-Dawley(SD)ラット(n = 4)を使用してください。ラットを5%イソフルランが入ったタンクに2〜3分間置き、動物がゆっくりと呼吸して独立した活動をしないようにしてから、斬首する前に75%エタノールを使用して消毒します。
2. ハサミで背中の皮膚を約3cmカットし、脊柱を切除します。脊柱管を慎重に開いて脊髄を露出させます。
3. 2〜3mLの氷冷D-ハンクス平衡塩溶液(HBSS)を入れた60mmのシャーレに脊髄を維持します。
4. 解剖学的構造に基づいて、腹側根(運動神経)を切除し、次に後側根(感覚神経)を解剖顕微鏡で切除します。次に、氷冷したD-ハンクス平衡塩溶液(HBSS)に入れます。
5. HBSSを取り外した後、はさみで神経を3〜5 mmの小片にスライスし、0.25%(w / v)トリプシン1 mLで37°Cで18〜20分間消化します。次に、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEMを3〜4mL補給して消化を止めます。
6. 混合物を約10回穏やかにピペットで上下させ、800 x gで5分間遠心分離します。その後、上清を捨て、10%FBSを添加したDMEMの2〜3mLに沈殿物を懸濁します。
7. 400メッシュフィルターを使用して細胞懸濁液をろ過し、次に60mmのペトリ皿で細胞を接種し、5%CO2で37°Cで培養します。培養の4〜5日後、90%のコンフルエンスに達した後、継代0(p0)線維芽細胞とSCを分離します。
8. SCの分離と培養(図1)
   1. 1x PBSを使用して細胞を一度洗浄します。60 mmのペトリ皿あたり0.25%(w / v)トリプシン(37°C)1 mLを添加し、室温で8〜10秒間細胞を消化します。その後、10%FBSを添加したDMEMを3mL添加して消化を止めました。
   2. 混合物をピペットでそっと吹き付けて、SCを取り外します。次に、SCを回収し、800 x gで5分間遠心分離します。
   3. 上清を廃棄し、残渣を10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2μMフォルスコリン、および10ng/mLHRGを含む3mLのDMEMに懸濁し、コーティングされていない60mmのシャーレで細胞に接種します。37°Cで30〜45分間培養した後、線維芽細胞(いくつかの線維芽細胞はSCで消化されます)が皿の底に付着します。
   4. 上清(SCを含む)を別のポリ-L-リジン(PLL)コーティングした中皿に移し、37°Cで2日間培養します。

結果

図 1:感覚線維芽細胞と運動線維芽細胞およびSCの分離および精製ステップを示す概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
D-ハンクの平衡塩溶液	ギブコ	14170112
DMEM	コーニング	10-013-履歴書
解剖顕微鏡	オリンポス	SZ2-ILST
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	10099-141C
フォルスコリン	シグマ	F6886-10MG
0.25%(w / v)トリプシン	ギブコ	〒25200-072
カルチャーディッシュ
遠心分離管
カバースリップ
ポリ-L-リジン
CO2インキュベーター

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