内皮細胞との共培養中のアジドシュガーによる神経細胞表面マーカーの標識

要約

出典:Bai, Q., et al.シアログリカンの代謝標識による初代神経幹細胞および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、マウスの脳内皮細胞と初代皮質幹細胞を共培養し、Ac4ManNAz(アジドシュガーパーO-アセチル化N-アジドアセチルマンノサミン)を使用して細胞表面糖タンパク質を標識するプロトコールを示しています。この方法により、初代細胞における細胞表面タンパク質の選択的な濃縮と同定が可能になります。

プロトコル

1. 透過性支持インサートにおけるマウス内皮培養物の調製

>注:BEND3セルは製造元の指示に従って維持されます。

1. 500 mLのDMEMに50 mLのFBSと5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンを加えて、BEND3細胞培地(BM)を調製し、よく混合します。
2. ディッシュから培地を吸引し、BEND3細胞培養物を1 mLのPBSで1回洗浄します。0.25%トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)1 mLを細胞に加え、37°Cで4分間インキュベー
トします。
3. 細胞に1mLのBMを添加してトリプシン-EDTAを中和し、ピペットで優しく上下させて細胞を完全に解離させます。細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブとペレットに移し、室温(RT)で400 x gで5分間遠心分離します。
4. チューブから上清を吸引し、9 mLの新鮮なBMで細胞を再懸濁し、1 mLの細胞懸濁液を1つの透過性サポートインサートに加えます。マトリックスの底部チャンバーでウェルごとにさらに2 mLの新鮮なBMを加えます。細胞を1日培養し続けます。

2. 神経内皮共培養とAc4ManNAz標識システムの構築

1. ある日、インサートにBEND3細胞をめっきした後、まず下部チャンバー内の培地を穏やかに吸引し、次にインサートを吸引します。インサートの表面を事前に温めたDMEM(ダルベッコの改良イーグルメディウム)で3回洗います。インサートの外面は、あらかじめ温めたDMEMですすいで
洗浄します。
2. 予熱したAM(接着培地)1 mLを1つのインサートに加え、インサートを初代皮質細胞のあるウェルに移します。共培養物を37°Cおよび5%CO₂で12時間インキュベー
トします。
3. Ac4ManNAzをDMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解してストック濃度200 mMを達成します。神経内皮共培養をセットアップしてから12時間後、ボトムチャンバーあたり1 μLのAc4ManNAzストックとインサートあたり0.5 μLのストックを共培養に追加します。プレートをすぐに静かに振って、培地をよく混ぜます。コントロールセルには、同量のDMSOを追加します。
4. 細胞をさらに5日間、37°Cおよび5%CO₂で培養します。10x bFGFを再供給培地(RM)としてAMを調製します。この間に、インサートあたり100 μLのRMとボトムチャンバーあたり200 μLのRMを追加して、内皮細胞と神経細胞を隔日で再供給します。再給餌中は、Ac4ManNAzまたはDMSOを培養物に供給しないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベンド3	ATCCの	CRL-229
DMEM	ギブコ	11960044
L-グルタミン	ギブコ	25030081	1%
ピルビン酸ナトリウム	シグマ	P5280	1%
N2サプリメント	ギブコ	17502048	1 から 100
N-アセチル-L-システイン	シグマ	A7250	1 mM
B27サプリメント	ギブコ	17504044	1 から 50
ポリ-L-リジン	シグマ	P4707
基本的な線維芽細胞成長因子	ギブコ	PHG0261	10 ng/mL
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122	1%
ウシ胎児血清	ギブコ	10099141	10%
HBSSの	ギブコ	14175095
トリプシン-EDTA、0.25%	ギブコ	25200056
DPBSの	ギブコ	14190094
トランズウェル	コーニング	3450