マウス実質細動脈からの脳内皮チューブの準備

要約

出典: Hakim, M. A., et al., Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、マウスの脳実質から内皮管を分離する方法を実演しています。酵素による消化と機械的解離の組み合わせにより、このプロセスにより、内皮細胞が無傷のチューブが得られます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 解決策と薬

1. 生理的塩水(PSS)
   1. 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)、および10 mMグルコースを使用して、最低1 LのPSSを調製します。
   2. 脳細動脈の解剖および内皮管の分離に必要なCaCl₂(ゼロCa²⁺ PSS)を欠く溶液を調製します.
      手記：すべての溶液を超高純度脱イオンH2Oで調製し、続いてろ過(0.22μm)します。最終製品にpH 7.4が含まれ、浸透圧が290〜300 mOsmであることを確認してください。
2. ウシ血清アルブミン(BSA、10%)
   1. 凍結乾燥したBSA粉末1gをゼロCa²⁺ PSSのビーカー10mLに溶解します。ビーカーを覆い、BSAが溶解するまでゆっくりと攪拌しながら少なくとも2時間待ちます。
   2. 10 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して溶液をろ過し、-20°Cで保存する1 mLアリコートを調製します。
3. 解剖ソリューション
   1. 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL の Zero Ca²⁺ PSS に加え、総容量 50 mL にします。
   2. 溶液を細動脈解剖用のペトリ皿に移します。
4. 解離ソリューション
   1. 5 μL の CaCl₂ 溶液 (1 M) と 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL の Zero Ca²⁺ PSS に加えると、総容量は 50 mL になります。溶液を室温で少なくとも1時間インキュベートします。
5. 酵素
   1. 100 μg/mL パパイン、170 μg/mL ジチオエリスリトール、250 μg/mL コラゲナーゼ (タイプ H ブレンド)、40 μg/mL エラスターゼを含む 1 mL の消化液を調製します
      手記： 酵素活性はさまざまですが、成功したプロトコールには、パパインに≥ 10単位/mg、コラゲナーゼに≥ 1単位/mg、エラスターゼに≥ 5単位/mgの酵素活性が必要になる可能性があります
       

>2. 実質細動脈の分離

>注:このプロトコルでは、中大脳動脈(MCA)から発生し、脳実質に埋め込まれた細動脈が選択されます。細動脈は、前述のように11、修飾されて単離されます。

1. 鋼ピン(直径0.2mm、長さ11〜12mm)を使用して、炭を注入したシリコンポリマーコーティング(深さ≥50cm)を含むシャーレ内の冷解剖液で分離された脳を固定します。
2. 鋭利で整列した解剖ハサミを使用して、MCAの周囲に脳組織の長方形(長さ:5 mm、幅:3 mm)(図1B)を切断し、組織セグメントの上部がCircle of Willisからの分岐点を過ぎていることを確認します。脳のもう一方の半球から別の長方形の脳組織を切り取り、必要に応じてより多くの細動脈にアクセスします。
3. スチールピン(直径:0.1 mm、長さ:13〜14 mm)を使用して、MCAを上(Circle of Willisから遠位)に向けて、分離した脳組織セグメントを皿に固定します。.ピンの近くに浅い切開を慎重に行い、小さな鉗子でピアを取り除き、一方の端からもう一方の端に向かってゆっくりと剥がします(図1C)。必要に応じて、他の組織セグメントからピアを取り外して、より多くの細動脈にアクセスします。MCAから分岐した実質細動脈を持つ単離された軟膜をピンで皿に慎重に固定し、細動脈が損傷しないように実質細動脈を解剖します(図1D)
   手記：細動脈が実質からピアで簡単に引き出せない場合は、細い鉗子を使用して、ウィリスの輪からのMCA分岐点から始めて脳を掘ります。細動脈の位置を特定し、細動脈の周りの組織を慎重に緩め(図1E)、細動脈の上端を保持しながら細動脈を実質からゆっくりと引き出します(図1F)。脳組織の1つの長方形から複数の細動脈(長さ:~1.5-2mm)を分離できます。
4. 細動脈が清潔で組織が付着していないことを確認し、残っている遠位枝を切り取ります(図2A)。この清潔で無傷の細動脈を酵素消化に使用してください。あるいは、必要に応じて、内皮チューブの準備のための酵素消化のために、各細動脈を2つの部分(長さ:0.75-1 mm)に切断します><。  

>3. 実質細動脈の消化と内皮チューブの調製

1. 機器とピペットの配置
   手記：脳からの動脈内皮管の分離は以前に説明されています13,18。現在のプロトコルには、実質 (脳内) 細動脈からの内皮の分離のための変更が組み込まれています。複数の細動脈または/または細動脈片を一緒に使用して酵素消化を行うことができます。
   1. 内皮チューブを調製するためのトリチュレーション装置13を、チャンバーを支持するアルミ製ステージとマイクロマニピュレータを用いて組み立てる。対物レンズ(5x-60x)とコンピューターモニターに接続されたカメラを備えた顕微鏡を組み立てます。ステージと検体の隣にポンプコントローラーでマイクロシリンジを固定します。
   2. マイクロシリンジピストンの上に鉱物油を埋め戻したトリチュレーションピペットを固定します。ポンプコントローラー付きのマイクロシリンジを使用して、ピペット内の気泡を避けながら、解離溶液を鉱物油の上にあるトリチュレーションピペット(~130 nL)に引き込みます。
2. 細動脈セグメントの部分消化
   1. 100 μg/mL パパイン、170 μg/mL ジチオエリスリトール、250 μg/mL コラゲナーゼ、40 μg/mL エラスターゼが入った 10 mL ガラス管に、無傷の細動脈セグメントを 1 mL の解離溶液に入れます。細動脈セグメントを34°Cで10〜12分間インキュベートします。
   2. 消化後、酵素溶液を室温で3〜4mLの新鮮な解離溶液と交換します。
3. 細動脈内皮チューブの分離
   注:酵素溶液の消化と置換に続いて、1つまたは複数の部分的に消化されたセグメントを、モバイルプラットフォームに取り付けられた超融合チャンバー内の解離溶液に移します。100倍から200倍の倍率で観察しながら、部分的に消化されているが壊れていない血管セグメントを1つ選択し、顕微鏡で焦点を合わせます。
   1. マイクロシリンジインジェクターに取り付けられたトリチュレーションピペットをチャンバー内の解離溶液に入れ、消化された容器セグメントの一端近くに置きます。ポンプコントローラーで1〜3 nL / sの範囲内のレートを設定して、穏やかなトリチュレーションを実現します。
   2. 100倍から200倍の倍率を維持しながら、細動脈セグメントをピペットに引き込み、次に排出して外膜細胞と平滑筋細胞を解離させます(図1B)。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷の「チューブ」として残るまで、血管セグメントを縮小します><。 手記：トリチュレーション中に必要に応じて、先端の細い鉗子を慎重に使用して、解離した外膜と内部弾性薄板を内皮チューブから取り除きます。通常、数回のトリチュレーションで無傷の内皮チューブが得られます。
   3. マイクロマニピュレーターを使用して、内皮チューブの両端をチャンバー内のガラスカバースリップに固定し、ホウケイ酸ガラスピンピペットで固定します(図2C、D)。
4. 細動脈内皮チューブの固定
   1. 解離溶液を超融合溶液(2 mM CaCl₂を含むPSS)に交換し、非内皮物質がチャンバーから洗い流されるようにします。
   2. モバイルプラットフォームに固定された内皮チューブを、連続的超融合および細胞内または蛍光記録/イメージング用に設計された顕微鏡リグに移します。
   3. 実験中にPSSの連続送達を適用します。インライン流量制御バルブを使用して、実験全体を通して流量(5-7 mL/min)を手動で設定し、層流と一致しながら、溶液の流れの供給を真空吸引の程度に一致させます。バックグラウンドデータおよび/または色素のロードを取得する前に、内皮チューブの超融合のためにチャンバーに ≥5 分間の PSS フローを流します。

結果

図1:実質細動脈の解剖と単離。(A)無傷のCircle of Willisを持つ単離されたマウスの脳。(B)MCAを含む脳組織の解剖された長方形の断片(白い矢印)。(C)組織の上部からの軟膜の分離(細動脈、青矢印)。(D)細動脈(青い矢印で囲まれたもの)が中大脳動脈(黄色の矢印)に接続されているもの。(E)脳組織内の細動脈(青矢印)を同定した。(F)ほぐれた組織から細動脈(青い矢印)を引き抜きます。パネルEおよびFは、細動脈の分離のための代替方法を示していることに注意してください(プロトコルステップ3.2.3を参照)。スケールバー = 2 mm (A、B、C)、0.2 mm (D)、および 1 mm (E、F)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バスチラー(Isotemp 500LCU)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13874647
ホウケイ酸ガラスキャピラリー(ピン留め)	ワーナー・インストゥルメンツ	G150T-6
ホウケイ酸ガラスキャピラリー(シャープ電極)	ワーナー・インストゥルメンツ	GC100F-10
ホウケイ酸ガラスキャピラリー(トリチュレーション)	World Precision Instruments (WPI)、サラソタ、フロリダ州、米国	1B100-4
BSA: ウシ血清アルブミン	シグマ	A7906
CaCl2:塩化カルシウム	シグマ	223506
コラゲナーゼ(H型ブレンド)	シグマ	C8051
データ集録デジタイザ	Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国	デジデータ 1550A
解剖皿(ガラスペトリ、チャコールシルガード底)	Living Systems Instrumentation、セント・オールバンズ・シティ、バーモント州、アメリカ	DD-90-S-BLKの
ジチオエリスリトール	シグマ	D8255
DMSO:ジメチルスルホキシド	シグマ	D8418
エラスターゼ(ブタ膵臓)	シグマ	E7885
フローコントロールバルブ	ワーナー・インストゥルメンツ	FR-50
蛍光システムインターフェース、ARCランプ&電源、ハイパースイッチ、PMT	Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国	IonOptixシステム
鉗子(先端の細い、鋭利な)	FSTの	デュモン #5 & デュモン #55
グルコース	Sigma-Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)	G7021
HEPES:(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)	シグマ	H4034-J
KCl:塩化カリウム	シグマ	P9541
MgCl2:塩化マグネシウム	シグマ	M2670
マイクロマニピュレーター	シスキユー	MX10
マイクロピペットプーラー(デジタル)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA (米国カリフォルニア州ノヴァト	P-97またはP-1000
顕微鏡(ニコン倒立型)	Nikon Instruments Inc.、米国ニューヨーク州メルビル	TS2
顕微鏡(ニコン倒立型)	ニコンインスツルメンツ株式会社	エクリプス TS100
顕微鏡ステージ(アルミ)	シスキユー、グランツパス、オレゴン州、米国	8090P
マイクロシリンジポンプコントローラー	World Precision Instruments (WPI)、サラソタ、フロリダ州、米国	SYS-MICRO4
NaCl:塩化ナトリウム	シグマ	S7653
パパイン	シグマ	P4762
位相コントラスト対物レンズ	ニコンインスツルメンツ株式会社	(Ph1 DL; 10倍 & 20倍)
ハサミ(3mmおよび7mmブレード)	Fine Science Tools (or FST)、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ	モリア MC52 & 15000-00
はさみ (バンナススタイル; 9.5 mm & 3 mm ブレード)	世界の精密機器	555640S、14364
温度コントローラー(デュアルチャネル)	ワーナー・インストゥルメンツ	TC-344BまたはC
バルブ制御システム	ワーナー・インストゥルメンツ	VC-6

の の 型 の ) の 型